非小細胞肺癌患者中循環(huán)腫瘤細胞的預(yù)測作用

王漢萍 張力

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京100730

非小細胞肺癌患者中循環(huán)腫瘤細胞的預(yù)測作用

王漢萍 張力#

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京100730

惡性腫瘤患者的血液中可檢測到循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）。轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌中外周血CTC與疾病的復(fù)發(fā)及治療反應(yīng)的臨床相關(guān)性已經(jīng)被確立。研究晚期肺癌患者中CTC與臨床的相關(guān)性對指導(dǎo)臨床治療的非常重要。CTC可能成為臨床上提示肺癌預(yù)后；預(yù)測疾病進展；指導(dǎo)治療的重要因素，將CTC檢測轉(zhuǎn)化到臨床實踐中并進一步改善標準化的CTC檢測技術(shù)有重要意義。

循環(huán)腫瘤細胞；非小細胞肺癌；診斷；預(yù)測療效

CTC是從腫瘤的原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落下來進入外周血液循環(huán)中的腫瘤細胞。在惡性腫瘤的病程中，上皮組織來源的實體腫瘤可以各種不同的狀態(tài)存在于人體中，包括初始時的惰性狀態(tài)、較強侵襲性的狀態(tài)，以及腫瘤從局部迅速播散到血液或淋巴循環(huán)中的強侵襲狀態(tài)等[1]。CTC最早發(fā)現(xiàn)于1869年，一個轉(zhuǎn)移性癌癥患者的尸檢報告中首次對此類細胞進行了描述[2]。約108個血細胞中可以檢測到一個CTC即可提示腫瘤轉(zhuǎn)移。具有強轉(zhuǎn)移性和侵襲性的表型往往丟失了部分上皮細胞的特征而獲得了更多類間質(zhì)細胞特有的轉(zhuǎn)移潛能，這也是CTC具有不同于一般腫瘤細胞的獨特特征的相關(guān)機制[3]。以上過程被稱為上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換（epithelialmesenchymal transitions，EMT），這種轉(zhuǎn)換在疾病進展和腫瘤轉(zhuǎn)移時均有發(fā)生，包括上皮細胞變成類成纖維細胞的外觀改變、上皮細胞分化標記物（如細胞角蛋白和E-鈣黏素）的下調(diào)，以及間質(zhì)標記物（波形蛋白、纖連蛋白和N-鈣黏素）的表達等改變[4-5]。

1 CTC和肺癌

在轉(zhuǎn)移性乳腺癌[6-7]、結(jié)直腸癌[8]和前列腺癌[9]中，CTC與腫瘤的臨床相關(guān)性已被確認。關(guān)于非小 細 胞 肺 癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）和CTC的相關(guān)性也已有諸多報道[10-11]。肺部惡性腫瘤中有75%～80%為NSCLC，絕大部分NSCLC患者在診斷時都已處于疾病晚期，患者缺乏有效的系統(tǒng)治療，疾病經(jīng)治療后也容易復(fù)發(fā)，這導(dǎo)致了晚期NSCLC的總生存期（overall survival，OS）較短。臨床分期是NSCLC患者最重要的預(yù)后因素，在早期NSCLC患者中年齡和性別也是重要預(yù)后因素[12]。目前晚期NSCLC患者的標準治療方案為含鉑雙藥化療方案[13-14]，加或不加貝伐珠單抗[15]。部分確定存在表皮生長因子受體（epithelial grow th factor receptor，EGFR）基因活性突變或存在間變淋巴細胞激酶（anaplasticlymphomakinase，ALK）重排的NSCLC患者可以使用特異性的酪氨酸激酶抑制劑（吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼）或ALK抑制劑（克唑替尼）治療，臨床療效明顯優(yōu)于標準化療方案[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)來源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移部位的CTC中也可以檢測到以上基因異常，因臨床實踐中獲取新鮮的腫瘤組織經(jīng)常比較困難，而利用血液樣本分析CTC卻可以常規(guī)進行，這就為肺癌患者的診斷和治療提供了便利[1，19-20]。

2 CTC的富集和檢測方法

可靠的CTC檢測方法重復(fù)性好，并可以對CTC進行計數(shù)和特征分析。根據(jù)CTC的生物學(xué)或物理學(xué)特征，很多實驗室都分別研究出了多種富集CTC的技術(shù)和方法[21]。但目前臨床中尤其是肺癌研究中最常使用的方法主要有兩種：①Cell-Search?系統(tǒng)（Veridex公司），是一種以上皮細胞黏附分子（epithelial celladhesionmolecule，EpCAM）為基礎(chǔ)的免疫吸附富集系統(tǒng)；②ISET技術(shù)（Rarecells Diagnostics公司），是一種以過濾器為基礎(chǔ)的通過上皮性腫瘤細胞的大小來分離的體積排除技術(shù)。

2.1 CellSearch?系統(tǒng)

CellSearch?系統(tǒng)是一個半自動化的技術(shù)，通過一種包被了抗EpCAM抗體的磁性納米顆粒富集血液中表達EpCAM的細胞。富集的樣本隨后進行熒光標記，標記的抗體為白細胞標志物CD45和一組細胞角蛋白抗體，將EpCAM（+）CK（+）DAPI（+）CD45（-）的細胞界定為CTC。Cell-Search?系統(tǒng)的主要局限性是其不能檢測EpCAM陰性的腫瘤細胞。但最近有研究發(fā)現(xiàn)在EpCAM陰性的CTC中有EMT表型相關(guān)的標記物（如CD146）的表達，可望改善這個系統(tǒng)的敏感性[22-24]。CellSearch?系統(tǒng)是目前唯一被FDA批準用于幫助提示乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌的預(yù)后和檢測治療反應(yīng)的程序[6，9，25-28]。

2.2 ISET技術(shù)

該技術(shù)是一種以過濾為基礎(chǔ)的方法，根據(jù)細胞大小來分離CTC。用一個過濾裝置過濾外周血，該裝置含10個小格，可以同時加多個樣本。和凈化后的血細胞相比，CTC的直徑較濾孔大（＞8mm）。從血樣中捕獲的CTC在細胞染色后可直接顯示在濾器上，細胞的形態(tài)特征可得到很好的保留。過濾后，覆蓋的濾膜進行自然干燥后，就可進一步進行染色和分析。通過這種方法可簡化血樣的處理，不需要利用上皮標記物來富集細胞。

2.3 CellSearch?和ISET的比較

根據(jù)表1，檢驗值（貴州民族學(xué)生F1均值）和標準值（美式英語母語使用者F1均值）的均值不同，其中F1檢驗值在緊元音和松元音中均略高于標準值，說明男性貴州學(xué)生總體較母語男性使用者開口度更大，因而舌位也較低，但兩者不具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異。

由Farace等進行的一項比較CellSearch?和ISET的研究[29]共入組了60例不同組織來源的轉(zhuǎn)移癌患者，結(jié)果顯示這兩項技術(shù)在富集CTC細胞方面存在一些差別，其原因可能為CellSearch?只能捕獲EpCAM陽性的細胞而漏掉了間質(zhì)表型的細胞。Farace等[29]還認為，ISET除了能對CTC進行計數(shù)外，還能更精確地提示預(yù)后及為轉(zhuǎn)移性肺癌患者的個體化治療決策提供進一步的分子檢測結(jié)果。

Krebs等[30]比較了使用兩種方法分離未經(jīng)化療的Ⅲa～Ⅳ期NSCLC患者CTC的區(qū)別，并觀察到了具有特異性上皮標記物表達的腫瘤細胞簇及其增殖狀態(tài)。但是利用ISET方法能在80%的患者中檢測到CTC，而通過CellSearch?方法只能檢測到23%的陽性率。43%的患者通過ISET方法檢測到了非增殖的腫瘤細胞簇而這些非增殖的細胞簇卻不能通過CellSearch?方法檢測到。該研究提示兩種技術(shù)都能檢測到晚期NSCLC患者的血樣中存在CTC，但晚期腫瘤中EpCAM的低表達可能導(dǎo)致CellSearch?的敏感性降低。

Chinen等[31]報道了1例轉(zhuǎn)移性NSCLC患者接受卡鉑和紫杉醇治療并在不同隨訪時間點監(jiān)測CTC的結(jié)果。Chinen等在進行實驗時平行使用以細胞角蛋白依賴性的免疫磁珠分離（上皮抗原依賴性）方法和ISET方法，結(jié)果顯示免疫磁珠分離技術(shù)在反映患者的臨床情況和療效時不如ISET可靠。實際上，雖然免疫磁珠分離方法通過CTC數(shù)量的減少提示了治療的療效，但ISET（上皮性抗原非依賴性）反而顯示了CTC數(shù)量有所增加，且后者的結(jié)果與臨床情況惡化、治療無效相一致。

2.4 其他富集和檢測方法

為進一步提高CTC檢測的敏感性和特異性，研究者們也對其他免疫標記抗體技術(shù)和新的分子鑒定技術(shù)進行了研究。非小細胞肺癌與其他腫瘤相比存在一些特異性的分子，如NSCLC細胞表面葉酸受體存在高表達。于躍等[32]通過免疫磁珠陰性富集方法捕獲外周血中的CTC，再用腫瘤特異性葉酸配體-寡核苷酸耦合物標記捕獲CTC，洗去沒有結(jié)合的富余耦合物后，洗脫下特異性結(jié)合的耦合物的寡核苷酸用于定量PCR擴增分析，捕獲的CTC通過免疫熒光染色鑒定為腫瘤細胞。結(jié)果顯示，這一技術(shù)應(yīng)用在153例NSCLC患者中檢測靈敏度為73.2%，特異度為84.1%。

3 CTC對肺癌診斷的作用

有研究檢測了CTC的可行性，并分析了其與肺癌的臨床相關(guān)性。該研究入選了9例接受手術(shù)治療的NSCLC患者，用CellSearch?系統(tǒng)分別檢測了術(shù)前和術(shù)后患者血液中的CTC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)前有1例患者CTC為陽性，術(shù)后即刻有3例患者CTC為陽性，但10天后均變?yōu)殛幮浴Ｇ一颊咧形浑S訪14個月無腫瘤復(fù)發(fā)，這也和患者CTC的變化相符合[33]。

Hoffman等[35]報道使用ISET技術(shù)能檢測到NSCLC術(shù)后患者血液中的CTC。250例患者的血液樣本分別由10名細胞病理學(xué)家隨機加樣到濾器上。其中惡性疾病患者、不確定惡性疾病患者及良性疾病患者分別有83%、12%和5%檢測到了CTC；而作為陰性對照組的59例健康患者中則沒有檢測到CTC。

Hoffman等[36]將利用ISET方法得到的CTC的數(shù)量和患者的術(shù)前評估指標、病理分期及預(yù)后進行了相關(guān)性分析。208例血液樣本來自于手術(shù)的NSCLC患者，39例陰性對照血樣來自于健康人。有49%的NSCLC患者檢測到了CTC，而健康人均未檢測到CTC。中位隨訪24個月后發(fā)現(xiàn)，CTC≥50個/10 m l的NSCLC患者的術(shù)后無疾病進展生存期（progression-free survival，PFS）和OS都相對較短，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義（P=0.001和P=0.002），以上結(jié)果顯示CTC能提示早期Ⅰ～Ⅱ期患者的高復(fù)發(fā)風(fēng)險[36]。

4 CTC對肺癌預(yù)后的提示作用

一項研究聯(lián)合CellSearch?和ISET富集并檢測了210例手術(shù)切除的早期NSCLC患者的CTC。結(jié)果顯示，與CellSearch?相比，ISET具有更好的提示預(yù)后敏感性的特點；而單變量分析和多變量分析的結(jié)果均顯示，可檢測到CTC（≥2個/7m l）的患者的PFS顯著短于無CTC的患者（P＜0.0001）[37]。

Krebs等[38]通過一項單中心前瞻性研究對CTC在NSCLC患者中的預(yù)后作用及化療對CTC的影響進行了探討。101例未接受過化療的Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者通過CellSearch?檢測了CTC經(jīng)過一個周期標準化療前后的變化。21%的患者在基線狀態(tài)時CTC＞2個/7.5 m l。單變量分析結(jié)果顯示，Ⅳ期患者的CTC數(shù)量高于Ⅲ期患者，化療前CTC＜5個/7.5m l的患者其PFS和OS顯著優(yōu)于CTC≥5個/7.5 m l者（P＜0.001）。且對70例患者CTC的一個周期化療前后變化進行多變量分析后發(fā)現(xiàn)，CTC數(shù)量仍然是PFS的獨立預(yù)后因素（P＜0.001），也是 OS的最重要的預(yù)后因素（P＜0.001）。

有兩項薈萃分析結(jié)果[39-40]都闡述了CTC對肺癌患者預(yù)后的前瞻性。其中一項薈萃分析的結(jié)果提示，在基線狀態(tài)時及治療后外周血中存在CTC的患者預(yù)后較差。而且，晚期腫瘤患者更易檢測到CTC；且CTC的檢出率和治療前患者的T（腫瘤大?。（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）、M（遠處轉(zhuǎn)移）分期相關(guān)，也和治療后患者的T分期相關(guān)[39]。

另一項薈萃分析同樣發(fā)現(xiàn)，存在CTC的NSCLC患者的預(yù)后差。該薈萃分析入選了分別使用了多種不同檢測技術(shù)（RT-PCR、免疫細胞化學(xué)和CellSearch?等）的20項研究。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示CTC和腫瘤大小、淋巴結(jié)受累情況及遠處轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，但和組織學(xué)類型無關(guān)。而且，CTC陽性的NSCLC患者的PFS（P＜0.0001）和OS（P＜0.0001）均較CTC陰性的患者差[40]。

上述研究的結(jié)果提示，盡管CTC在分離方面尚存在一些問題，但隨著檢測技術(shù)的不斷進步，使得CTC可能成為判斷NSCLC預(yù)后的一個重要指標。

5 CTC分子學(xué)檢測對于肺癌靶向治療的指導(dǎo)意義

目前，NSCLC患者的初始治療方案主要根據(jù)EGFR突變和ALK重排的檢測結(jié)果來制定。這些突變結(jié)果可以預(yù)測患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑和ALK抑制劑的敏感性。但是，在晚期NSCLC中，通過活檢取得的少量腫瘤組織有時并不夠用于進行分子學(xué)檢測。而通過檢測CTC上存在的一些特殊蛋白并確定相關(guān)基因突變類型和分子特征，可有助于制定NSCLC的治療策略和檢測治療療效。

Maheswaran等[41]對比分析了分別利用轉(zhuǎn)移性NSCLC患者CTC上的DNA和相應(yīng)的血漿中循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）進行分子檢測的可行性，并采用以過濾為基礎(chǔ)的使用Ep-CAM包被抗體的CTC芯片（CTC-chip）技術(shù)。試驗共分離了27例患者的CTC，并對其中12例患者的CTC進行了分子學(xué)分析。EGFR突變檢測使用蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)法，或標準測序法或兩種方法聯(lián)合檢測。除1例外，其他所有預(yù)測是陽性結(jié)果的患者（92%）的血液中都檢測到了EGFR活性突變，包括那些接受了EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療的和含有T790M突變的患者。但是，使用以上方法學(xué)來評估EGFR突變狀態(tài)尚需進一步的確認，而分析ctDNA中的基因組學(xué)改變則有望成為將來檢測EGFR突變的新途徑。

Punnoose等[42]在34例轉(zhuǎn)移性NSCLC患者中研究了使用游離CTC進行生物標記物檢測的可行性，發(fā)現(xiàn)通過免疫熒光法可以準確地測定24份CTC＞3個/7.5m l全血樣本中的EGFR表達。Punnoose等[43]還發(fā)現(xiàn)用免疫熒光法分析EGFR突變表達及用定量的RT-PCR（qPCR）法對最常見的基因（AKT1、BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、PIK3CA）改變進行突變分析有助于CTC和ctDNA的檢測。根據(jù)CTC和ctDNA檢測到的EGFR突變結(jié)果和相應(yīng)的腫瘤組織的檢測結(jié)果相吻合，也進一步確認了利用CTC進行突變檢測的可行性；但是，該研究也顯示，ctDNA的敏感性要高于CTC。

Ran等[44]報道了一項使用單個CTC來檢測EGFR突變的新技術(shù)。為優(yōu)化這種方法，來自NSCLC NCI-H1975細胞系（包含EGFR雙突變：L858R和T790M）的10個細胞被加入到7.5 m l的全血中，使用標記有抗白細胞表面抗原抗體的磁珠陰性富集細胞，隨后評估EGFR突變狀態(tài)。CTC的富集和其上皮標記物表達水平無關(guān)，腫瘤細胞在切片上鋪開后通過激光細胞顯微解剖技術(shù)進行分離。將切片上的腫瘤細胞進行計數(shù)，拍照，并用337 nm的激光束進行單獨的顯微解剖，然后將腫瘤細胞放入細胞溶解液中，隨后進行DNA基因擴增和PCR測序。95%的CTC產(chǎn)生PCR擴增子，85%可以確認有L858的突變，45%可以確認有T790M突變。來自5個病例的數(shù)據(jù)初步確認了在NSCLC患者中使用這種方法的可行性，但是還需要行進一步的研究來確認這些結(jié)果的可重復(fù)性，并需進一步的深入探討。

Pailler等也研究了利用CTC檢測ALK重排狀態(tài)的最佳敏感性和特異性[45]。結(jié)果提示，在18例ALK陽性的NSCLC患者中篩查EML4-ALK融合基因是確實可行的。研究使用ISET方法富集CTC后在濾器上直接進行原位熒光雜交。所有組織標本中ALK陽性患者通過在CTC上均檢測到了ALK重排，而在14例ALK陰性患者中僅1例在CTC上檢測到ALK重排。

為進一步改善所富集的CTC的分子特征，增加CTC對診斷的幫助，并以此為根據(jù)來選擇治療手段，可能需要對擴增的PCR產(chǎn)物應(yīng)用下一代測序（NGS）技術(shù)。NGS技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的一代測序技術(shù)（如Sanger），可望實現(xiàn)利用單個細胞和ctDNA來檢測單個核苷酸突變或同時檢測更多的基因改變的想法[46-47]。

6 CTC對于療效的預(yù)測作用

很多研究都提示CTC計數(shù)可預(yù)測NSCLC治療的療效。但是，它和治療反應(yīng)的相關(guān)性是否可靠，首先取決于CTC檢測方法的可靠性。在治療的不同時間點，CTC數(shù)量會出現(xiàn)和療效相關(guān)的動態(tài)變化，且這種變化所提示的療效應(yīng)該和治療的臨床療效、實驗室判定的客觀療效相符合。以此為終點，很多研究都顯示了接受化療的患者隨訪期間的CTC變化可能比標準的影像學(xué)技術(shù)（如CT和PET等）能提供更多相關(guān)療效的信息。

Hirose等[48]的前瞻性研究評估了33例接受吉西他濱和卡鉑化療的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的CTC計數(shù)變化和化療療效之間的相關(guān)性。CTC的檢測采用CellSearch?方法，臨界值為≥1個/7.5 m l。研究顯示36.4%的患者CTC陽性，15.2%的患者基線時CTC數(shù)量≥5個/7.5m l。結(jié)果提示，CTC陽性患者和CTC陰性患者之間的化療療效無顯著差別，但是CTC陽性患者中出現(xiàn)腫瘤進展的比例（66.7%）顯著高于CTC陰性者（23.8%），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02）。

一項多中心Ⅱ期臨床研究觀察了41例接受厄洛替尼和帕妥珠單抗治療的晚期NSCLC患者在治療期間CTC變化對影像學(xué)療效及臨床療效的預(yù)測意義，使用CellSearch?檢測CTC[43]。結(jié)果顯示，大部分患者（78%）都存在CTC，在基線時幾乎有一半患者（42%）的CTC≥5個/7.5m l。其中高基線CTC和治療療效之間存在相關(guān)性（P=0.019）。而且，治療后CTC的下降和更長的PFS相關(guān)（P= 0.05）。

另一項關(guān)于37例接受多西他賽和吉西他濱治療的晚期NSCLC患者的CTC改變和臨床療效之間的相關(guān)性的研究也使用CellSearch?檢測CTC，臨界值為≥2個/7.5 m l，結(jié)果顯示：24%的患者基線時CTC≥2個/7.5 m l。治療2個月后（第3個周期化療前）CTC陽性者具有更長的PFS（中位9.4個月）和OS（中位4.3個月），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義[49]。

Muinelo-Romay等[50]報道了CTC在43例晚期NSCLC患者中的預(yù)后價值及其在監(jiān)測化療療效時的作用。患者分別在基線狀態(tài)、第2個周期及第5個周期進行含鉑聯(lián)合化療前連續(xù)采血，用CellSearch?檢測CTC，并主要計數(shù)形態(tài)上完整的CTC。其中CTC≥5個/7.5 m l的患者具有較低的中位PFS（4.1個月）和中位OS（4.6個月），而CTC＜5個/7.5m l的患者的中位PFS和中位OS分別為7.6個月和10.7個月，大部分患者在第2個周期化療時CTC水平有明顯下降，這提示CTC可預(yù)測患者接受治療后的總體療效，也提示CTC在治療過程中有提示治療是否起效的作用。

7 小結(jié)

大量研究已經(jīng)顯示CTC在提示NSCLC的腫瘤分期和轉(zhuǎn)移發(fā)生中有顯著作用，因此，將CTC檢測轉(zhuǎn)化到臨床實踐中并進一步改善標準化的CTC檢測技術(shù)有重要意義。CTC可能成為臨床上提示肺癌預(yù)后的重要因素，并可以在NSCLC患者的治療期間通過反復(fù)取樣來監(jiān)測疾病進展。利用CTC檢測腫瘤的分子標志物，也可為靶向治療提供依據(jù)。

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R734.2

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10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.04.05

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2014-11-14）