化學(xué)發(fā)光檢測光子計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)特性

陳文洋，鄒明強(qiáng) ，劉 峰，李錦豐

(1.吉林大學(xué)儀器科學(xué)與電氣工程學(xué)院，吉林長春 130021;2.中檢國研(北京)科技有限公司，北京 100123;3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

1 引 言

化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，與待測的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學(xué)放光標(biāo)記物，加入化學(xué)放光系統(tǒng)的其他相關(guān)產(chǎn)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或定性檢測。它是繼放射免疫分析、酶免分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項(xiàng)最新免疫測定技術(shù)［1］。

化學(xué)發(fā)光免疫用發(fā)光物作為標(biāo)記時(shí)的靈敏度很高，但是瞬間發(fā)光限制了光信號(hào)的持續(xù)時(shí)間。過短的持續(xù)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致檢測的結(jié)果很不穩(wěn)定，不具有很好的重現(xiàn)性?，F(xiàn)有的研究表明，在化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)中加入增強(qiáng)劑能夠延長發(fā)光信號(hào)的持續(xù)時(shí)間至幾十分鐘甚至24 h。同時(shí)，傳統(tǒng)的免疫分析又具有特異性。根據(jù)這樣的特點(diǎn)，結(jié)合傳統(tǒng)的免疫分析與化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)，形成了一種新型的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，即增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫分析(Enhanced chemiluminescenceimmunoassay，ECLEIA)。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析的檢出值最小可達(dá)10－15mol/L，其靈敏度比常規(guī)的酶免疫分析高3～5個(gè)數(shù)量級(jí)。由于具有靈敏度高、發(fā)光量子效率高、使用快速、簡便、應(yīng)用面廣、化學(xué)發(fā)光信號(hào)持續(xù)穩(wěn)定時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析在免疫分析、蛋白質(zhì)印跡、核酸檢測等諸多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［2-12］。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析中使用最多的4種標(biāo)記物分別是魯米諾、吖啶酯衍生物、異魯米諾及其衍生物、過氧化物酶和堿性磷酸酶，其中魯米諾是開始應(yīng)用最早、最有效的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)之一［13］?；瘜W(xué)發(fā)光是指物質(zhì)由于吸收了發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)的化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物分子從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的分子在回到基態(tài)時(shí)，便會(huì)發(fā)射出特定波長的光。從統(tǒng)計(jì)角度來說，化學(xué)發(fā)光發(fā)射的光子脈沖與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)組分含量相關(guān)［14-16］?；瘜W(xué)發(fā)光的檢測主要通過光子計(jì)數(shù)的方式進(jìn)行。光子計(jì)數(shù)器作為一種高靈敏度的弱光檢測裝置，其鑒別閾值、光電倍增管高壓等因素對(duì)信噪比的影響等已被儀器開發(fā)人員進(jìn)行了大量的研究［17-20］。但是對(duì)于檢測對(duì)象的光子脈沖發(fā)射統(tǒng)計(jì)規(guī)律對(duì)檢測結(jié)果的影響的研究還從未見諸報(bào)道，而增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析化學(xué)發(fā)光體系的光子脈沖發(fā)射統(tǒng)計(jì)過程卻又對(duì)檢測結(jié)果有重要影響。

本文首次測量了增強(qiáng)魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的光子脈沖統(tǒng)計(jì)特性，并根據(jù)其脈沖發(fā)射時(shí)間統(tǒng)計(jì)特性對(duì)化學(xué)發(fā)光光子計(jì)數(shù)檢測裝置的設(shè)計(jì)進(jìn)行了數(shù)值分析。研究結(jié)果表明，增強(qiáng)魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的光子脈沖發(fā)射間隔呈Weibull分布。在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)烈度較低時(shí)，脈沖連續(xù)發(fā)射的可能性增加;而當(dāng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)劇烈時(shí)，由于發(fā)光效率降低，所以脈沖連續(xù)發(fā)射的可能性降低，影響化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果的線性，應(yīng)予以修正。為了保證化學(xué)發(fā)光的檢測結(jié)果具有合理的信噪比，應(yīng)注意在檢測儀器設(shè)計(jì)中對(duì)光子計(jì)數(shù)時(shí)間做動(dòng)態(tài)調(diào)整。

2 光子脈沖統(tǒng)計(jì)特性測試方案及實(shí)施

2.1 實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)采用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被-待測抗原-酶(HRP)標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、過氧化氫和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使其產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。分別配制不同濃度的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光體系(光子發(fā)射頻率不同)。采用示波器記錄不同發(fā)射頻率下共3 014個(gè)光子脈沖在光子計(jì)數(shù)裝置中的光電倍增管(PMT)輸出波形及最后輸出的方波信號(hào)。根據(jù)波形數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不同發(fā)射頻率下的光子脈沖幅度(PMT輸出信號(hào))、寬度、脈沖間隔(輸出方波信號(hào))的統(tǒng)計(jì)規(guī)律。

2.2 測量裝置

實(shí)驗(yàn)裝置為自主開發(fā)的96通道增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫檢測儀原理樣機(jī)，如圖1所示。其中光電倍增管采用濱松公司的CR110光電倍增管，計(jì)數(shù)器使用ATMEL公司的ATmega8單片機(jī)自帶的16位計(jì)數(shù)器T1(ATmega8晶振頻率8 M)。示波器采用Tektronix DPO3000數(shù)字熒光示波器(300 MHz，2.5 G/s，記錄數(shù)據(jù)長度 5 M)。測試框圖如圖2所示。

圖1 化學(xué)發(fā)光檢測儀樣機(jī)Fig.1 Prototype of Chemiluminescence detector

圖2 光子脈沖測量實(shí)驗(yàn)裝置Fig.2 Experimental device of photon pulse measurement

3 結(jié)果與討論

3.1 光子脈沖強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)特性分析

典型光電倍增管的光脈沖強(qiáng)度分布如圖3所示。各級(jí)倍增極熱電子發(fā)射的脈沖高度小于光信號(hào)的脈沖高度，脈沖數(shù)很多;光陰極的熱電子發(fā)射及反饋光子的光電激發(fā)產(chǎn)生的脈沖高度等于光信號(hào)的脈沖高度，脈沖數(shù)較少;宇宙射線激發(fā)產(chǎn)生的脈沖高度大于光信號(hào)的脈沖高度，脈沖數(shù)極少。如果采用脈沖高度甄別器對(duì)處于高脈沖高度基準(zhǔn)(ULD)和低脈沖高度基準(zhǔn)(LLD)之間的信號(hào)脈沖進(jìn)行甄別，可實(shí)現(xiàn)高信噪比的單光子計(jì)數(shù)，有利于提高系統(tǒng)的探測靈敏度［21］。

圖3 光子脈沖強(qiáng)度分布與噪聲信號(hào)強(qiáng)度分布圖Fig.3 Relationship between the intensity of photon pulse and the intensity of noise signal

圖4 實(shí)測光子脈沖強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of actual measurement photon pulse intensity

圖4給出了對(duì)觸發(fā)計(jì)數(shù)的3 014個(gè)光子脈沖的強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)，從圖中可以看出超低脈沖得到了很好的抑制，脈沖高度統(tǒng)計(jì)不存在明顯的截止，表明實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)閾值選取適當(dāng)。

3.2 化學(xué)發(fā)光光子計(jì)數(shù)脈沖寬度統(tǒng)計(jì)特性分析

對(duì)光子計(jì)數(shù)器的PMT后信號(hào)脈沖的半高全寬進(jìn)行測量，結(jié)果如圖5所示。其統(tǒng)計(jì)特性呈現(xiàn)Gaussian分布。采用Gaussian擬合計(jì)算PMT后光子脈沖半寬度均值為53.6 ns，標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.3 ns，測量數(shù)為 3 014。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脈沖整形使光子脈沖最后形成的方波脈沖寬度展寬，并且脈沖寬度的差異也增大了，但統(tǒng)計(jì)特征仍然呈現(xiàn)Gaussian分布，如圖6所示。Gaussian擬合統(tǒng)計(jì)結(jié)果均值為89.3 ns，標(biāo)準(zhǔn)偏差為26.5 ns，測量數(shù)為3 014。這是由于脈沖整形比較器觸發(fā)電平低于脈沖信號(hào)強(qiáng)度平均值所致。

圖5 光子脈沖寬度統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistics of photon pulse width

圖6 整形后的方波脈沖寬度統(tǒng)計(jì)Fig.6 Statistics of the square wave pulse width after shaping

3.3 脈沖間隔與計(jì)數(shù)頻率之間的統(tǒng)計(jì)規(guī)律分析

從光子計(jì)數(shù)脈沖整形原理分析，光子脈沖的脈沖寬度和脈沖幅度與光子脈沖頻率無關(guān)，但光子脈沖間隔與光子脈沖頻率(對(duì)應(yīng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)測量了不同光脈沖發(fā)射頻率下的脈沖間隔統(tǒng)計(jì)分布，數(shù)據(jù)表明脈沖間隔符合Weibull分布，如圖7所示。

其概率密度函數(shù)為［22］:

其中a為尺度參數(shù)，b為形狀參數(shù)，t為脈沖間隔時(shí)間。如果用f(t)和F(t)分別表示概率密度函數(shù)和分布函數(shù)，則

圖7 光子脈沖間隔統(tǒng)計(jì)分布圖Fig.7 Interval statistical distribution map of photon pulse

h(t)為瞬時(shí)脈沖發(fā)生概率函數(shù)。當(dāng)b=1時(shí)，h(t)為常量，此時(shí)各種脈沖間隔發(fā)生的概率是相等的，也就是滿足指數(shù)分布;當(dāng)b＜1時(shí)，h(t)是減函數(shù)，隨著距離上一個(gè)脈沖發(fā)生時(shí)間的延長，下一次脈沖發(fā)生的概率減小;當(dāng)b＞1時(shí)，h(t)是增函數(shù)，隨著距離上一個(gè)脈沖發(fā)生時(shí)間的延長，下一次脈沖發(fā)生的概率將增加。

實(shí)驗(yàn)測量了平均脈沖頻率為3 691，7 368，17 692，28 646，33 085 Hz的幾段連續(xù)光子脈沖序列的脈沖間隔規(guī)律，并根據(jù)Weibull分布函數(shù)進(jìn)行了數(shù)值擬合，再對(duì)所得尺度參數(shù)和形狀參數(shù)隨化學(xué)發(fā)光光子脈沖頻率變化關(guān)系進(jìn)行數(shù)值擬合，結(jié)果如圖8所示。尺寸參數(shù)a隨著頻率的增加呈冪級(jí)數(shù)衰減，表明脈沖平均間距縮小。值得注意的是形狀參數(shù)b在化學(xué)發(fā)光頻率較低的情況下小于1，表明此時(shí)脈沖扎堆連續(xù)發(fā)射的幾率更大，這可能與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)烈度較低時(shí)的局部反應(yīng)不均勻有關(guān);在高光子脈沖發(fā)射頻率情況下，b逐漸接近于1，表明化學(xué)發(fā)光反應(yīng)逐漸均勻。

當(dāng)光子脈沖發(fā)射頻率為5～1 000 kHz時(shí)，根據(jù)擬合公式推算的堆積引起的脈沖漏記結(jié)果如圖9所示(假設(shè)光子脈沖間距小于2倍光子脈沖寬度，即180 ns時(shí)為堆積發(fā)生條件)。圖中對(duì)比了b=1的情況，也就是光子發(fā)射完全與間隔無關(guān)的情況下堆積發(fā)生的概率。脈沖堆積幾率隨光子脈沖發(fā)射率的增加而升高。當(dāng)光子脈沖發(fā)射率較低時(shí)，脈沖堆積幾率很低;當(dāng)光子脈沖頻率達(dá)到300 kHz左右時(shí)，脈沖堆積幾率已經(jīng)上升到5%以上。對(duì)于實(shí)驗(yàn)所采用的化學(xué)魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系，當(dāng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加到100 kHz以上時(shí)，化學(xué)發(fā)光效率開始明顯降低，此時(shí)發(fā)射光子密度低于理想情況，所以堆積幾率也有所降低。在實(shí)際檢測應(yīng)用中可以根據(jù)這一規(guī)律對(duì)光子計(jì)數(shù)檢測結(jié)果進(jìn)行校正。

圖8 光子脈沖間隔統(tǒng)計(jì)分布圖。(a)尺度參數(shù)a隨光子頻率的變化;(b)形狀參數(shù)b隨光子脈沖頻率的變化。Fig.8 Interval statistic distribution map of photon pulse.(a)Variation of scale parameter a with the photon frequency.(b)Variation of shape parameter b with photon pulse frequency.

圖9 脈沖堆積與光子脈沖頻率的關(guān)系Fig.9 Relationship between the pulse accumulation and photon pulse frequency

3.4 化學(xué)發(fā)光信噪比與化學(xué)發(fā)光頻率和計(jì)數(shù)時(shí)間的關(guān)系

化學(xué)發(fā)光檢測信噪比計(jì)算公式如下:

式中η為量子效率，R為平均光子流，Rd為暗記數(shù)率，t為計(jì)數(shù)時(shí)間。將脈沖堆積引起的計(jì)數(shù)效率降低引入公式，并計(jì)算信噪比隨計(jì)數(shù)時(shí)間和光子脈沖頻率變化的規(guī)律，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知:在相同計(jì)數(shù)時(shí)間情況下，計(jì)數(shù)頻率越高則信噪比越高;在相同計(jì)數(shù)頻率情況下，計(jì)數(shù)時(shí)間越長則信噪比越高。

圖10 化學(xué)發(fā)光信噪比與發(fā)光頻率和計(jì)數(shù)時(shí)間的關(guān)系Fig.10 Signal to noise ratio of chemiluminescence vs.luminescence frequency and counting time

化學(xué)發(fā)光檢測的動(dòng)態(tài)范圍較大，樣品不可重復(fù)測量。如果設(shè)置固定的積分時(shí)間，則未知樣品檢測結(jié)果的信噪比將存在較大差異。因此，在實(shí)際化學(xué)發(fā)光檢測中可以實(shí)時(shí)監(jiān)控化學(xué)發(fā)光光子脈沖發(fā)射頻率，根據(jù)圖10結(jié)果動(dòng)態(tài)調(diào)整積分時(shí)間，保證測量結(jié)果的信噪比處于一個(gè)可以接受的范圍。

4 結(jié) 論

光子計(jì)數(shù)檢測方法結(jié)果需要針對(duì)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)射光子脈沖的統(tǒng)計(jì)特征進(jìn)行修正。在化學(xué)發(fā)光檢測應(yīng)用中，考慮樣品只能單次使用，為了保證將未知檢測樣品檢測結(jié)果信噪比控制在一個(gè)合理的范圍，應(yīng)采用動(dòng)態(tài)計(jì)數(shù)時(shí)間方式。總之，對(duì)于專用分析儀器的研究除了應(yīng)考慮檢測過程本身因素的影響，還應(yīng)針對(duì)檢測對(duì)象的特征進(jìn)行分析，以保證儀器具有良好的適用性。

［1］Wang J.Study on Immunoassay for Fumonisin B1［D］.Shanghai:Shanghai Jiao Tong University，2010(in Chinese).

［2］Zhou Y，Zhou T，Zhou R，et al.Chemiluminescence immunoassay for the rapid and sensitive detection of antibody against porcine parvovirus by using horseradish peroxidase/detection antibody-coated gold nanoparticles as nanoprobes［J］.J.Lumin.，2014，29(4):338-343.

［3］Fan F，Shen H Y，Zhang G J，et al.Chemiluminescence immunoassay based on microfluidic chips for α-fetoprotein［J］.Clin.Chim.Acta，2014，431:113-117.

［4］Ma L，Sun Y Y，Kang X J，et al.Chemiluminescence development of nanobody-based flow injection chemiluminescence immunoassay for sensitive detection of human prealbumin［J］.Biosens.Bioelectron.，2014，61:165-171.

［5］Zhang H S，Qi S W.A rapid and sensitive chemiluminescence immunoassay based on magnetic particles for squamous cell carcinoma antigen in human serum［J］.Clin.Chim.Acta，2011，412(17):1572-1577.

［6］Ma X X，Liu H Z，Tang J J，et al.Comparison of three enzyme-linked immunosorbent assay methods for quantitative determination of ricin［J］.Chin.J.Chem.(分析化學(xué))，2011，39(5):685-689(in Chinese).

［7］Zhang J R，Chen J，Liu Z M.Progress of electrochemical luminescence immunoassay technology［J］.Chin.J.Chem.(分析化學(xué))，2010，38(8):1219-1226(in Chinese).

［8］Zheng G J，F(xiàn)ang L Q，Chen H，et al.Magnetic microparticle chemiluminescence immunoassay method for determination of estriol in human urine［J］.Chin.J.Chem.(分析化學(xué))，2011，39(1):62-66(in Chinese).

［9］Xue P，Zhang Z J，Zhang X X.Chemiluminescent analysis of carcinoembryonic antigen in serum samples［J］.Chin.J.Chem.(分析化學(xué))，2011，39(1):95-98(in Chinese).

［10］Shu L T，Xu B S，Zhang P Y.Enhanced chemiluminescence enzyme immunoassay for determination of serum gastrin and establishment［J］.Chin.J.Lab.Diagn.(中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué))，2006，10(1):96-97(in Chinese).

［11］Chong K，Gui J，Tan K H.Enhanced chemiluminescence(ECL)for gene detection［J］.Plant Physiol.Commun.(植物生理學(xué)通訊)，1993，29(5):368-370(in Chinese).

［12］Wang Y，Zhu H Q，Chen H Z，et al.Protein imprinting technology［J］.Acta Univ.Med.Anhui(安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào))，2004，39(3):245-247(in Chinese).

［13］Wang C，Wu J，Zong C，et al.Chemiluminescent immunoassay and its application［J］.Chin.J.Chem.(分析化學(xué))，2012，40(1):3-10(in Chinese).

［14］Kricka L J.Chemiluminescence and bioluminescence analysis［J］.Ency.Mol.Biol.Moi.Med.，1996，1:322-332.

［15］Lin J M.Chemiluminescence Basic Theory and Application［M］.Beijing:Chemical Industry Press，2004(in Chinese).

［16］Zhao L X.Research and Application of The Chemiluminescence Enzyme-linked Immunoassay［D］.Beijing:Research Center for Eco-environmental Sciences，2005(in Chinese).

［17］Zhu Y，Ouyang J.Design and implementation of the single photon counter system［J］.Chin.J.Sci.Instrum.(儀器儀表學(xué)報(bào))，2007，28(4):29-30(in Chinese).

［18］Liu G F，Xiong K W，Liu W C.Study on the single photon counter system［J］.J.Sci.Teachers'College Univ.(高師理科學(xué)報(bào))，2011，31(2):67-70(in Chinese).

［19］Shao Y J，Zhu L Q，Guo Y K，et al.Single photon counting system and its noise analysis［J］.Modern Electron.Tech.(現(xiàn)代電子技術(shù))，2013，36(6):168-170(in Chinese).

［20］Zhao J P，Zhong Y X.Determination of single photon counting system for discriminating voltage［J］.Digital Technol.Appl.(數(shù)字計(jì)數(shù)與應(yīng)用)，2012，11:53-54(in Chinese).

［21］Wang T F.Method of improving the detectability of photon counting system based on PMT［J］.Opt.Electric.Inform.(光機(jī)電信息)，2009，26(3):37-42(in Chinese).

［22］Ma F S，Zhou W，Liu C B.The Six Sigma Management Statistical Guide to Using—MINITAB Guidance［M］.Beijing:China Renmin University Press，2007(in Chinese).