高效功能菌群RR的篩選及其群落分析

朱玲玉，謝學(xué)輝，劉娜，楊芳，俞承志，柳建設(shè)

（東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620）

隨著染料和印染工業(yè)的迅速發(fā)展，大量人工合成的色度高、難降解以及對生物有毒性污染物質(zhì)的排放，對環(huán)境以及人類健康造成了嚴(yán)重的威脅。因此，染料的降解已經(jīng)被認(rèn)為是紡織業(yè)廢水處理亟待解決的問題[1-2]。

國內(nèi)外常用的染料廢水處理方法主要有物理、化學(xué)和生物方法。利用物化方法處理印染廢水由于其高成本、處理規(guī)模有限且目標(biāo)污染物受限等特點，不適用于印染廢水處理常規(guī)工藝[3]。微生物處理印染廢水中難降解污染物被認(rèn)為是較為經(jīng)濟(jì)有效的方法。細(xì)菌、真菌、酵母、放線菌、藻類以及植物均對印染廢水中難降解的污染物質(zhì)有著一定的降解能力，然而細(xì)菌由于其生長迅速以及適應(yīng)性強等特點，目前已成為研究熱點[4-6]。

本工作利用梯度濃度壓力馴化法，從厭氧反應(yīng)器中篩選出對直接紅28 有具有良好脫色能力的混合菌群RR。研究其培養(yǎng)條件，如溫度、pH 值、鹽度、初始染料濃度，對混合菌群脫色效果的影響。傳統(tǒng)篩選方法中通常利用高營養(yǎng)的LB、蛋白胨培養(yǎng)基篩選功能菌株，這些功能菌株基本上對工程無機環(huán)境適應(yīng)性差、不易存活。本實驗篩選功能菌群RR 屬于低營養(yǎng)型，為了使功能菌群進(jìn)一步適應(yīng)工程無機環(huán)境，將培養(yǎng)基中葡萄糖去掉，旨在篩選出以染料為唯一氮源、碳源以及能量的功能菌群RM，并對功能菌群RR、RM 的脫色能力、群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析對比。

1 實 驗

1.1 實驗材料

1.1.1 染料

采用染料為偶氮類染料直接紅28（C.I. Direct Red 28），Tokyo Chemical Industry Co. Ltd.公司，分子式為C32H22N6Na2O6S2，相對分子質(zhì)量為696.66，特征波長λmax=500nm，分子結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。

1.1.2 培養(yǎng)基

馴化培養(yǎng)基：葡萄糖2g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.2g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g/L，NaCl 0.1g/L，染 料 50 ～200mg/L，pH 值調(diào)整至7.0±0.2。

圖1 直接紅28 分子結(jié)構(gòu)式

染料培養(yǎng)基：葡萄糖2g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.2g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g/L，NaCl 0.1g/L，染料200mg/L，pH 值調(diào)整至7.0±0.2。

培養(yǎng)基均在121℃滅菌20min 后冷卻備用。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

HITACHI U-2910 型紫外可見分光光度計，天美(中國)科學(xué)儀器有限公司；BIO-RAD DCODETM變性梯度凝聚電泳儀，美國伯樂公司；Gel DocTMXR+BIORAD 凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法

（1）高效功能菌馴化篩選過程 從運行良好的印染廢水生物處理系統(tǒng)厭氧反應(yīng)器取新鮮活性污泥用無菌玻璃珠在無菌條件下打散制成污泥懸液，取 20mL 加入含 80mL 馴化培養(yǎng)基的 250mL 錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為 35℃，培養(yǎng)基 pH 值為 7.0，24h 后轉(zhuǎn)入下一瓶馴化培養(yǎng)基中，待染料脫色率達(dá)到80%以上，增加馴化培養(yǎng)基中染料的質(zhì)量濃度，其染料濃度依次為 20mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L。通過此過程獲得了對直接紅28 有良好脫色性能的混合菌群RR。

（2）培養(yǎng)條件對菌株脫色效果的影響 分別將溫度（25～45℃）、pH 值（4～9）、鹽度（1～100mmol/L）、染料初始濃度（10～500mg/L）作為變量，保持其他條件不變，測定其對混合菌群脫色性能的影響?；緦嶒灄l件：以初始培養(yǎng)液 (未接菌懸液時) 為空白參比，接入染料培養(yǎng)基（染料濃度200mg/L）于 35℃培養(yǎng) 48h，每8h 測定其脫色率，每一條件做 3 組平行實驗。

（3）馴化以染料作為唯一氮源、碳源以及能量的功能菌群 將染料培養(yǎng)基中的葡萄糖去掉，染料濃度變?yōu)?0mg/L、30mg/L、50mg/L，通過此得到以直接紅28 作為唯一氮源、碳源以及能量的菌群RM，將其與功能菌群RR 進(jìn)行脫色比較。

（4）兩種混合菌群群落結(jié)構(gòu)解析 本實驗利用變性梯度凝膠電泳（DGGE），對混合菌群RR、RM進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。

①提取總DNA。分別取 1mL 培養(yǎng)至對數(shù)期的混合菌群RR、RM 菌液使用基因組抽提實劑盒(EZ-10Span column Genomic DNA Isolation Kit，生工生物工程 (上海) 股份有限公司)提取DNA.

②16S rDNA PCR 擴(kuò)增。用細(xì)菌通用引物對 (正向引物27F5'-AGAGTTYGATCCTGGCTCAG-3'； 反向引物1492R 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'[7])擴(kuò)增兩種混合菌群的16S rRNA 基因。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 體系為50μL，其組成為：無菌水34μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 4μL (2.5mmol/L)，MgCl23μL(25mmol/L)，引物各1μL (10μmol/L)、Taq DNA 聚合酶 1μL (2.5U/μL)，DNA 分別1μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 3min；94℃ 1min，55℃ 30s，72 ℃ 1min，共32 個循環(huán)；72 ℃10min。

③DGGE- PCR 擴(kuò)增。DGGE-PCR 的引物序列(選用細(xì)菌16S rDNA V3 區(qū)通用引物)如下所示：引物 338F- GC 序 列 ： GC clamp-5′- CCTACGGGAGGCAGCAG-3′；引物517R 的序列：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。擴(kuò)增程序：95℃ 5min；95℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 1min，共30個循環(huán)；72℃ 10min。

④DGGE 凝膠電泳及回收DNA 的擴(kuò)增、測序。變性梯度一般在20%～80%的范圍內(nèi)，根據(jù)情況用0～100%的變性溶膠調(diào)整混合而成，不同濃度梯度變性膠配方如表1 所示。本實驗采用50%～70%變性濃度膠，在溫度60℃、電壓110V 下，電泳9h。電泳完畢，將凝膠放入EB 中染色30min，然后利用BIO-RAD Gel DocTMXR 凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。將純化產(chǎn)物切下并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 分析方法

（1）混合菌群脫色液的紫外-可見光譜掃描。取脫色液 2mL，以10000r/min 的轉(zhuǎn)速離心10min，對上清液進(jìn)行 200～700nm 范圍的紫外-可見光譜掃描。

表1 不同濃度梯度變性膠配方

（2）分光光度法測定混合菌群脫色率。按20%接種量將菌群接種于250mL 錐形瓶中，染料最終質(zhì)量濃度為200mg/L，pH=7.0，35℃培養(yǎng)，每隔8h從染料脫色液中取出2mL，在10000r/min 下離心 10min，取上清液，以富集培養(yǎng)基為空白，測量上清液在染料特征波長處（500nm）的吸光度值，即 A500，以未加菌液的染料培養(yǎng)基為對照，其脫色率根據(jù)式（1）計算，并以此來表示菌群的脫色能力。

式中，A0為脫色前脫色培養(yǎng)基在500nm 的吸光度值；At為脫色后脫色培養(yǎng)基在500nm 的吸光 度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 混合菌群的篩選及脫色

采用梯度濃度壓力馴化法，經(jīng)過7 個染料濃度梯度的依次馴化、篩選，共8 個月的時間得到對直接紅28 有良好脫色效果的低營養(yǎng)型功能菌群RR?；旌暇篟R 在初始染料濃度為200mg/L 的條件，48h 后其脫色率均穩(wěn)定在90%以上，脫色效果最高可達(dá)96.16%。利用紫外-可見光譜全波長掃描脫色前后的樣品，其結(jié)果見圖2。功能菌群RR 對直接紅28 的12h、24h、36h、48h 的脫色率分別為61.61%、75.17%、84.16%、96.16%。

2.2 培養(yǎng)條件對混合菌群脫色作用的影響

2.2.1 pH 值對混合菌群RR 脫色作用的影響

本實驗分別對不同pH 值條件下，混合功能菌群RR 的脫色率進(jìn)行測定，如圖3 所示。實驗結(jié)果表明，在pH=7.0 時，功能菌群的脫色率達(dá)到最大為95.2%。功能菌群RR 在pH=4～8 時，脫色率均在60%以上，可見混合功能菌RR 在弱酸、弱堿及中性條件下均有較好的脫色效果，對條件改變適應(yīng)性強。

圖2 混合菌群 RR 對直接紅28 脫色的紫外-可見光掃描譜圖

圖3 pH 值對混合菌群RR 脫色作用的影響

功能菌群RR 在中性條件下，脫色率達(dá)到最大，國外相關(guān)研究也得到類似的結(jié)果。Patel 等[5]驗證混合功能菌群EDPA 在pH=0.7 的條件下，對酸性棕5脫色率達(dá)到最大。Prasad 等[8]篩選出對對直接紅28降解能力的微生Enterobacter sp. SXCR，最適pH 值為7.0。Anjaneya 等[9]的研究表明，中性條件下更有利于微生物生長、降解以及工程中應(yīng)用。相關(guān)研究表明，pH 值是在染料降解過程中是主要的影響因素，最適pH 值往往在6～10 之間[10-11]，對微生物降解染料也有著重要作用的因素依次為初始染料濃度、溫度、菌群數(shù)量、鹽度等。

2.2.2 溫度對混合菌群RR 脫色作用的影響

溫度對微生物的活性有著至關(guān)重要的影響，溫度過低微生物活性低，達(dá)不到良好的染料降解效果，溫度過高，微生物細(xì)胞失活，同樣降解效率低。如圖4 所示，從25℃起，隨著溫度的升高，染料脫色率不斷提高，45℃脫色率達(dá)到最大。當(dāng)溫度升到50℃時，脫色率驟減。雖然功能菌群RR 在45℃時降解率達(dá)到最大，為了滿足工程條件，同時降解率又可以得到保證，所以在后續(xù)實驗中，培養(yǎng)溫度設(shè)為35℃。

圖4 溫度對混合菌群RR 脫色作用的影響

由于溫度過高，會使細(xì)胞中降解酶活性失活，相關(guān)研究認(rèn)為超過35℃情況下，降解率就會降 低[12]。相反，本實驗篩選出的功能菌群RR 對直接紅28 的降解率在45℃達(dá)到最大，Jadhav 等[13]也得到類似的結(jié)論。

2.2.3 鹽度對混合菌群RR 脫色作用的影響

染料廢水中通常含有大量的 NaCl、Na2SO4等鹽分，鹽度過高會影響微生物細(xì)胞的滲透壓，從而會抑制微生物生長甚至導(dǎo)致微生物死亡，因此分離、馴化出有較高耐鹽性的微生物具有重要的意義。

本實驗分別研究不同鹽度（1～100mmol/L）情況下對功能菌群降解染料脫色率的影響，當(dāng)鹽度為2mmol/L 時，染料的脫色率達(dá)到最大。實驗表明（圖5），適量的鹽度對微生物的生長及脫色有促進(jìn)作用，而染料濃度過高，會使細(xì)胞脫水而死亡。在鹽度為1～100mmol/L 范圍內(nèi)，功能菌群RR 對直接紅28的脫色效率均在60%以上，說明功能菌群RR 有較好的耐鹽能力，適用于工程中稍高鹽度的情況。

2.2.4 初始染料濃度對混合菌群RR 脫色作用的 影響

染料的初始濃度會影響功能菌群對其降解效率主要是原因是高濃度的染料對微生物產(chǎn)生生物毒性以及識別底物的相關(guān)酶濃度相對降低[14]。在本實驗中（圖6），隨著初始染料濃度的升高，染料的降解率隨之降低。初始染料濃度在200mg/L 以內(nèi)，均可保證在48h 內(nèi)，染料的脫色率在80%以上，由此可見，功能菌群RR 對直接紅28 有著良好的脫色降解能力。

圖5 鹽度對混合菌群RR 脫色作用的影響

圖6 初始染料濃度對混合菌群RR 脫色作用的影響

2.3 以染料為唯一氮源、碳源、能量混合菌群RM篩選

2.3.1 混合菌群RM 的脫色性能

為適應(yīng)工程無機環(huán)境，旨在篩選出以染料作為唯一碳源、氮源以及能量的菌群，將馴化培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖去掉，同樣利用梯度濃度壓力馴化法，經(jīng)過3 個月的時間，篩選出對直接紅28 有一定脫色效果的菌群RM。初始染料濃度為50mg/L、pH=7.0、溫度為35℃條件下，48h后染料的脫色率為20.05%?；旌暇篟M 對直接紅28 沒有很高的去除效率，但也是將實驗室研究貼近工程無機環(huán)境一個很好的開端。今后可以將研究重點放在如何提高混合菌群RM 的脫色率上。利用紫外-可見光譜全波長掃描脫色前后的樣品，其結(jié)果見圖7。

圖7 混合菌群RM 對直接紅28 脫色的紫外-可見光掃描譜圖

國內(nèi)外許多學(xué)者也致力于以目標(biāo)污染物質(zhì)作為唯一碳源、氮源以及能量上的研究。Ren 等[15]從印 染廢水的活性污泥中發(fā)現(xiàn)了對染料有普遍降解能力的DN322 菌株，可以降解偶氮、蒽醌、三苯基甲烷類染料，并且 DN322 可以在降解的過程中把結(jié)晶紫用作唯一的碳源和能量，該菌株已經(jīng)投入到工程中應(yīng)用。李朝等[16]從土壤中分離出Rhodococcus sp.菌株，該菌株可以把PVA 作為唯一碳源和能量 生長。

2.3.2 功能菌群RR 與RM DGGE 群落分析對比

混合菌群RR、RM 群落分析凝膠電泳圖如圖8，測序及在Genbank 同源性比較結(jié)果如表2 所示?；旌暇篟R 及RM 中均存在對直接紅28 有降解能力的伯克霍爾德氏菌屬菌株Burkholderia sp.，該菌株在有無葡萄糖存在時均能存活，并對直接紅28 有一定的降解能力，有葡萄糖存在時對染料脫色率高于沒有葡萄糖存在。國外相關(guān)研究也表明伯克霍爾德氏菌屬 Burkholderia sp.對染料存在降解能力。Laszlo[17]證實，Burkholderia cepacia NRRL B-14803可以在厭氧條件下降解雙偶氮染料。Arora 等[18]指出Burkholderia sp. RKJ 800 以4-氯-2-氨基苯酚作為唯一碳源、能量，將其降解為氯離子、銨離子。Zhou等[19]驗證，Burkholderia vietnamiensis C09V 可以同時降解結(jié)晶紫和二價銅，并將結(jié)晶紫作為唯一碳源。研究證明，伯克霍爾德氏菌屬菌株（Burkholderia sp.）可在無機條件下對染料存在降解能力，工程應(yīng)用性極強。

功能菌群RR 中還存在其他兩種菌株，屬于鏈球菌屬（Streptococcus）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）。這兩種菌株在葡萄糖存在的條件下，可以存活并對直接紅28 存在一定的降解能力；在無葡萄糖存在的無機環(huán)境下，隨著馴化過程染料濃度不斷增加，鏈球菌屬菌株（Streptococcus didelphis strain）和克雷伯氏菌屬菌株（Klebsiella sp.）逐漸被淘汰。國外相關(guān)研究也證實，兩種菌株對染料存在降解能力。Cui 等[20]發(fā)現(xiàn)新篩選出的克雷伯氏菌屬Klebsiella sp. Y3 可以在厭氧的條件下，降解偶氮染料，并且在pH 值為4～9，溫度為30～42℃，鹽度為1%～4%時均有良好的降解能力。

圖8 混合菌群RR、RM 群落分析凝膠電泳圖

表2 DGGE 切膠條帶序列比對結(jié)果

3 結(jié) 論

從厭氧反應(yīng)器中利用梯度濃度壓力馴化法篩選出對直接紅28 有具有良好脫色能力的混合菌群RR。針對其染料脫色性能進(jìn)行了一系列的研究得出混合菌群RR 脫色最佳條件為：pH=7.0，溫度為45℃，鹽度為2mmol/L。在最適條件下，功能菌群RR 對直接紅28 的脫色率穩(wěn)定且在48h 內(nèi)均可達(dá)到90%以上。

為了進(jìn)一步適應(yīng)工程無機條件，篩選出以染料作為唯一氮源、碳源以及能量的功能菌群，遂將培養(yǎng)基中葡萄糖去掉，篩選出混合菌群RM?；旌暇篟M 在無機條件，初始染料濃度為50mg/L、pH=7.0、溫度為35℃條件下，48h 后染料的脫色率為20.05%。并對混合菌群RR、RM 進(jìn)行DGGE 群落分析，RR 主要為伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia sp.）、鏈球菌屬（Streptococcus）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.），菌群RM 主要為伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia sp.)。由此表明，伯克霍爾德氏菌屬菌株（Burkholderia sp.）可以在無機條件下生存，以染料為唯一碳源、氮源以及能量并對直接紅28存在一定的降解能力。

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