蠟狀芽孢桿菌菌株SMC的間甲酚降解特性及動力學

于晨陽，毛縝

（中國礦業(yè)大學(徐州)環(huán)境與測繪學院，江蘇 徐州 221116）

間甲酚作為我國優(yōu)先控制污染物甲酚的三種同分異構(gòu)體中的一種，毒性最大且最難降解，是有機化工中一種重要的原料，已經(jīng)廣泛地應用于人類日常生活中，由于其具有強烈的毒性和腐蝕性且在環(huán)境中持久存在，已被美國EPA 列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物的黑名單。我國地表水環(huán)境質(zhì)量標準中規(guī)定Ⅴ類水中揮發(fā)酚含量最高是1.0mg/L，同時在《污水綜合排放標準》中明確規(guī)定間甲酚最高允許排放濃度不超過0.5mg/L。因此，有效去除間甲酚對保護環(huán)境和人類健康而言是刻不容緩的。

目前含酚廢水的生物降解法相對于其他物化處理方法，具有經(jīng)濟、安全、殘留少、無二次污染等方面的優(yōu)點，且在應用方面更顯優(yōu)勢。但由于焦化、石化、制藥等行業(yè)排出的廢水中多元酚的濃度很 高[1]，其毒性會令很多微生物的生長和降酚活性受到抑制，導致傳統(tǒng)的生物法在去除高濃度的間甲酚方面效率偏低，而高效菌投加技術(shù)可以很大地發(fā)揮微生物的潛力，能夠有效地解決難降解的問題，所以分離高效降解菌株也受到了國內(nèi)外學者們的廣泛重視。付柳等[2]以間甲酚為基質(zhì)分離出復合菌種CDMs，當間甲酚初始濃度為551mg/L 時，完全降解所需時間為65h，而600mg/L 的間甲酚在65h 內(nèi)降解率僅為2.67%。Jiang 等[3]通過對野生熱帶假絲酵母菌進行氦氖激光輻射誘變獲得突變菌株CTM2，該菌株在5%的接種量下能降解300mg/L 的間甲酚，而在共基質(zhì)生物降解系統(tǒng)，0～500mg/L 濃度的苯酚能促進CTM2 對間甲酚的降解，在苯酚以350mg/L 濃度存在時，300mg/L 的間甲酚能在46h被完全降解。Pichiah Saravanan 等[4]從污水處理廠分離出一個混合菌群，在27℃、150r/min、接種量為1%條件下，間甲酚初始濃度為300mg/L 時能夠達到最大降解速率，完全降解100mg/L 的間甲酚所需時間為14h，但當初始濃度為900mg/L 時完全降解需要136h。由此可見，雖然國內(nèi)外文獻已有間甲酚降解菌株的報道，但是這些菌株耐受與降解的間甲酚濃度并不高。對于間甲酚生物降解代謝途徑方面的研究大致分為3 類：鄰位代謝途徑、間位代謝途徑和龍膽酸代謝途徑[5]。 鄰苯二酚是芳香烴類化合物降解的重要中間產(chǎn)物，因為幾乎所有的芳香烴類化合物都是先降解為鄰苯二酚，而后鄰苯二酚通過鄰位或間位雙加氧酶的作用進行裂解使苯環(huán)斷裂。

本實驗以焦化廠活性污泥作為原始菌源，旨在馴化篩選出一株以間甲酚為唯一碳源且具有高效降解能力的菌株，并對其降解特性以及降解動力學進行研究，以此為生物降解法提供高效降解菌菌源。同時，通過預測菌株降解間甲酚的趨勢來優(yōu)化生化處理的工藝條件，從而為提高菌株對間甲酚的降解效率方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

活性污泥取自圣戈班（中國）投資有限公司（原徐州鋼廠）焦化車間廢水處理站活性污泥。

馴化培養(yǎng)基由無機鹽溶液中添加一定濃度的間甲酚配制而成。各種無機鹽的含量為：KH2PO4，1.0g/L；K2HPO4，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.4g/L；CaCl2，0.01g/L；NaCl，0.6g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；FeCl3·6H2O，0.02g/L；NH4Cl，0.8g/L；間甲酚（200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1600mg/L、1800mg/L）。

1.2 菌種的馴化、篩選和分離

采用逐量分批馴化法進行馴化，取5mL 原始菌源接入裝有50mL 無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中（其中間甲酚濃度為50mg/L），共接2 瓶。一瓶置于恒溫振蕩器中于30℃、150r/min 條件下培養(yǎng)，另一瓶置于4℃冰箱中不培養(yǎng)。經(jīng)48h 培養(yǎng)后，將培養(yǎng)與不培養(yǎng)的三角瓶同時取出，搖勻。若培養(yǎng)瓶中液體渾濁度高說明已有菌增殖，則從培養(yǎng)瓶中取5mL 作為菌源接入50mL 間甲酚濃度為100mg/L 的無機鹽培養(yǎng)基中，重復上述培養(yǎng)與檢查。按照上面方法，不斷提高間甲酚在無機鹽培養(yǎng)基中的濃度，間甲酚的濃度分別為200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1600mg/L、1800mg/L，培養(yǎng)瓶中液體在間甲酚濃度為1800mg/L 不再變渾濁，所以取間甲酚濃度為1600mg/L 的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h 后的菌源進行稀釋涂布和劃線，挑取不同的單菌落，將所得單菌落分別接入以1600mg/L 間甲酚為唯一碳源的50mL 無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h后測定間甲酚剩余濃度，選取間甲酚降解率最大的菌株為馴化篩選得到的高效降解間甲酚菌株。

1.3 菌種鑒定

使用UNIQ-10 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒來提取菌株SMC 的基因組DNA。對提取的菌株基因組DNA 進行PCR 擴增，PCR 擴增儀程序設(shè)定的擴增反應條件如下：預變性94℃ 5min；循環(huán)94℃ 30s，55℃ 35s，72℃ 1min，35 個循環(huán)后于72℃再延伸8min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后利用UNIQ-10 柱式DNA 膠回收試劑盒回收。回收的產(chǎn)物送到上海生物工程服務有限公司進行16S rDNA序列的測定，并進行序列Blast 比對分析，取其近緣菌的16S rDNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 分析方法

菌體濃度采用光密度法，即采用可見分光光度計，在600nm 波長下測定菌懸液的吸光度（OD600）來代表間甲酚降解菌的濃度。吸光度值越高說明培養(yǎng)基中的菌體質(zhì)量濃度越高。間甲酚濃度采用采用4-氨基安替比林法[6]。根據(jù)吸光度和間甲酚含量的標準曲線得出樣品間甲酚的濃度，從而計算樣品中間甲酚的降解效率。

1.5 間甲酚降解菌降解特性分析

分別考察溫度、pH 值、搖床轉(zhuǎn)速、氮源的種類對間甲酚降解率的影響，進而確定菌株降解間甲酚的最適環(huán)境條件。測定菌株對間甲酚降解能力的試驗在最適降解條件下進行，取1%培養(yǎng)到對數(shù)期的菌株，接種到以不同間甲酚初始濃度為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時測定間甲酚殘余濃度。 1.6 間甲酚的降解動力學

由于間甲酚為有毒化合物，高濃度間甲酚的存在會對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用，目前的研究中，很多學者[7-10]都采用Haldane 模型來描述間甲酚為底物時菌體的生長動力學。在本實驗中也觀察到了明顯的底物抑制作用，故也選擇Haldane 模型來模擬在以間甲酚為唯一碳源時菌株的降解動力學行為。方程式為式（1）。

式中，μmax為細胞最大比生長速率，h-1；μχ為菌體的比生長速率，h-1；Ks為菌體生長半飽和系數(shù)，mg/L；S 為底物的濃度，mg/L；Ki為底物抑制系數(shù)，mg/L。利用MATLAB 軟件對μ 和S 作非線性最小二乘回歸分析，從而得到μmax、Ks和 Ki的值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的分離與鑒定

用以間甲酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基進行菌種的馴化，培養(yǎng)48h 后，在間甲酚濃度為1600mg/L的培養(yǎng)基上篩選出一株降解率達到97.8%的高降解率的菌株，將其命名為SMC。

該菌在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)24h 后的菌落為淺黃色的圓形菌落，直徑達2.5～5mm，表面凸起有光澤，邊緣光滑，再培養(yǎng)一段時間后觀察到邊緣變粗糙。通過革蘭氏染色后觀察該菌顏色呈紫色，為革蘭氏陽性菌。菌株SMC基因組DNA 經(jīng)過PCR 擴增后產(chǎn)物的電泳圖譜如圖1 所示。根據(jù)菌株SMC 測定的16S rDNA 序列與Genebank 中已報道的16S rDNA 序列進行同源性比較，利用MEGA 軟件構(gòu)建Neighbour-Joining 樹，結(jié)果表明菌株SMC 的16S rDNA 序列與在Genebank登記Bacillus cereus（蠟樣芽孢桿菌）同源性相似度達到99.7%，初步證明菌株SMC 為Bacillus 屬。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

目前，國內(nèi)外許多學者在篩選間甲酚高效降解菌方面也做了大量工作，已篩選出多種間甲酚降解微生物。包括姜巖等[3]發(fā)現(xiàn)的熱帶假絲酵母菌、宋正光等[8]報道的麥芽糖假絲酵母菌、白靜[9]報道的糞產(chǎn)堿桿菌、彭麗花等[11]報道的Citrobacter farmeri、吳坤等[12]報道的雜色云芝（Coriolus versicolor），但關(guān)于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）菌株降解間甲酚的報道還沒有。本文作者在對與間甲酚結(jié)構(gòu)具有較高相似性的苯酚的降解研究中卻發(fā)現(xiàn)有不少學者分離出芽孢桿菌屬的菌株，如Arutchelvan 等[13]分離到的Bacillus brevis 菌株、袁利娟等[14]分離到的Bacillus sp. JY01、李淑彬等[15]分離到的Jp-A 和于彩虹等[16]篩選出的B3 與本實驗菌株SMC 同屬于蠟狀芽孢桿菌（ Bacillus cereus），由此推測芽孢桿菌屬菌株同樣適用于苯酚的降解。有研究表明，該菌也能以甲苯、氯酚類和硝基酚類等芳香烴類物質(zhì)作為唯一碳源生長[15]。同一微生物體可以降解多種芳烴可使該微生物具有適應復雜的污染環(huán)境的優(yōu)勢，因此對于成分復雜的含酚工業(yè)廢水，高效廣譜的降解菌的篩選在含酚工業(yè)廢水的處理方面十分重要，而這正可以體現(xiàn)出芽孢桿菌屬的SMC 菌株降解含酚工業(yè)廢水的優(yōu)越性。

圖1 菌株SMC PCR 產(chǎn)物電泳圖譜

圖2 菌株SMC Neighbour-Joining 樹

2.2 環(huán)境因素對間甲酚降解的影響

2.2.1 溫度對菌株SMC 降解間甲酚的影響

將菌株SMC 在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，以1%接種量接種到以1600mg/L 間甲酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，在不同溫度下（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、150r/min 氣浴恒溫振蕩中培養(yǎng)24h 后測定間甲酚殘留濃度。

由圖3 可以看出，在20～35℃范圍內(nèi)，間甲酚的降解率都在90%以上，說明菌種都能有效地降解間甲酚，其中30℃時菌種降解率最高。在小于20℃或大于35℃時，菌株SMC 對間甲酚的降解效果明顯的降低，這是由于超出適宜的溫度都會抑制微生物的生長。低溫會降低微生物的代謝活性，而過高的溫度會導致代謝過程中所需的酶失活或變性，以致無法實現(xiàn)對間甲酚的代謝。故本實驗中菌種最適溫度為30℃。

2.2.2 pH 值對菌株SMC 降解間甲酚的影響

分別調(diào)節(jié)以1600mg/L 間甲酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基的pH 值為3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11，將菌株SMC 在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，以1%接種量接種，30℃、150r/min 氣浴恒溫振 蕩中培養(yǎng)24h 后，測定間甲酚殘留濃度。

圖3 溫度對間甲酚降解率的影響

結(jié)果如圖4 所示，當pH 值在6～7.5 之間，間甲酚降解率隨pH 值升高而不斷增大；pH 值在7.5～9 之間時，降解率變化緩慢，基本保持平穩(wěn)，但降解率均達到90%以上，pH 值為7.5 時降解效果最好；當pH 值大于9 以后，間甲酚降解率呈迅速下降之勢。培養(yǎng)基以NH4Cl 作為氮源，在菌種對氮源需求下，細胞會吸收離子NH4+，使得無機鹽培養(yǎng)基中pH 值會下降，所以隨著培養(yǎng)基初始pH 值逐漸升高，酸性得到中和而減弱對降酚作用的影響。但當培養(yǎng)基過于偏堿時，菌株仍會受到堿性侵害，影響正常的生理活動，從而導致降解率下降。故本實驗中菌種采用最適pH 值為7.5。

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對菌株SMC 降解間甲酚的影響

將菌株SMC 在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，以1%接種量接種到以1600mg/L 間甲酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，在30℃、不同搖床轉(zhuǎn)速下（0r/min、50r/min、100r/min、150r/min、200r/min）氣浴恒溫振蕩中培養(yǎng)24h 后，測定間甲酚殘留濃度。

結(jié)果如圖5 所示，搖床轉(zhuǎn)速可在某種程度上反映菌種對溶解氧的需求[11]，提高搖床的轉(zhuǎn)速可以提高菌株SMC 的間甲酚降解率。這可能是由于轉(zhuǎn)速的加快提高了菌體同間甲酚的接觸面積和氧氣傳遞速率，但是達到150r/min 以上時，對降酚率的影響不大，但當轉(zhuǎn)速大于200r/min 有可能會影響細菌對底物在降解前的吸附從而降低降解效率[11]。考慮動力的因素，本實驗搖床最佳轉(zhuǎn)速確定為150r/min。

圖4 pH 值對間甲酚降解率的影響

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對間甲酚降解率的影響

2.2.4 不同間甲酚初始濃度對菌株SMC 降解能力的影響

將菌株SMC 在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，以1%接種量接種到以不同初始濃度間甲酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，在最佳培養(yǎng)條件下，30℃、150r/min 氣浴恒溫振蕩中培養(yǎng)，定時取樣，測定間甲酚剩余濃度，繪制間甲酚降解曲線。

結(jié)果如圖6 所示，初始濃度為1000mg/L、1200mg/L、1400mg/L、1600mg/L、1800mg/L 的間甲酚，降解率達95%所需時間分別為16h、24h、32h、46h、70h。而且菌株SMC 在48h 內(nèi)對初始濃度為1600mg/L 的間甲酚降解率達到97.81%，初始濃度為1800mg/L 的間甲酚經(jīng)過菌株72h 的降解，降解率能達到98.06%。但初始濃度為1900mg/L 時，培養(yǎng)基中菌濃度逐漸減少，而且降解效果在72h 后依然不明顯，降解率僅為5%左右。因此認為菌株SMC對間甲酚最大耐受能力為1900mg/L。查閱文獻，發(fā)現(xiàn)目前發(fā)表的間甲酚降解菌株的間甲酚耐受濃度沒有本實驗獲得的菌株SMC 高，且降解間甲酚的性能也沒有菌株SMC 好[2，3，12-13，17]。由此可以看出，SMC 具有很強的降解間甲酚的能力，是一株間甲酚高效降解菌。

2.3 間甲酚降解動力學方程

圖6 菌株SMC 不同間甲酚初始濃度的降解曲線

圖7 不同間甲酚初始濃度對菌株比生長率的影響

通過MATLAB 軟件對實驗數(shù)值進行非線性最小二乘回歸，得到 Haldane 方程的動力學參數(shù)為：μmax=0.01252h-1，KS=34.58mg/L，Ki=479.5mg/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.932。擬合曲線和實驗值的對比見圖7。從圖7 可以看出，理論值和實驗值擬和較好，菌體 的比生長速率隨著底物濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，所得的動力學方程也能較好地描述實驗中的反應趨勢。有研究證明，Ks值較低而Ki較高的菌株，其耐受性和降解能力都會更好[18]。本研究中的菌株SMC 的Ks值比之前報道的菌株更低，而且Ki值更高[7-10]。這和前面得出的該菌種有著高的降解性和耐受力的結(jié)論顯然是符合的，而且這種耐受特性正是由該菌種的遺傳特性所決定。

3 結(jié) 論

（1）從某焦化廠活性污泥中分離到一株能利用間甲酚作為唯一碳源生長的菌株SMC，屬革蘭氏陽性菌，對其16SrDNA 序列進行分析，初步確定為Bacillus cereus（蠟樣芽孢桿菌）。

（2）SMC 降解間甲酚的最佳條件：溫度為30℃，pH 值為7.5，轉(zhuǎn)速為150r/min。在最佳降解條件下，該菌株在48h 內(nèi)對濃度1600mg/L 的間甲酚降解率達97.81%，72h 內(nèi)對濃度為1800mg/L 的間甲酚降解率達98.06%，得到菌株SMC 對間甲酚的最大耐受能力為1900mg/L。

（3）按照Haldane 模型進行非線性最小二乘曲線擬合，得到菌株SMC 降解間甲酚的動力學參數(shù)為μmax=0.01252h-1，KS=34.58mg/L，Ki=479.5mg/L，由擬合曲線的趨勢再次證明菌株SMC 對高濃度間甲酚具有較高的耐受性和較好的降解能力。因此，該菌株有可能成為工業(yè)含酚廢水生物降解法的強化菌株，有進一步研究開發(fā)的價值。

[1] 李淑彬，陳振軍. 微生物降解酚類化合物的研究進展[J]. 華南師范大學學報：自然科學版，2005（4）：136-142.

[2] 付柳，任源，韋朝海. 間甲酚高效降解菌的篩選及其降解特性[J]. 化工進展，2008，27（7）：1032-1037.

[3] Jiang Yan，Cai Xun，Wu Di，et al．Biodegradation of phenol andm-cresol by mutated Candida tropicalis[J]. Journal of Environmental Sciences，2010，22（4）：621-626.

[4] Pichiah Saravanan，Pakshirajan K，Prabirkumar Saha. Batch growth kinetics of an indigenous mixed microbial culture utilizing m-cresol as the sole carbon source[J]. Journal of Hazardous Materials，2009，162：476-481.

[5] 姚海艷. Lysinibacillus cresolivorans 的間甲酚降解特性及動力學研究[D]. 廣州：華南理工大學，2011.

[6] 國家環(huán)境保護總局. 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 北京：中國環(huán)境科學出版社，2002.

[7] Yao Haiyan，Ren Yuan，Deng Xiuqiong，et al．Dual substrates biodegradation kinetics of m-cresol and pyridine by Lysinibacillus cresolivorans[J]. Journal of Hazardous Materials，2011，186（2-3）：1136-1140.

[8] 宋正光，王國英，岳秀萍，等. 麥芽糖假絲酵母菌降解苯酚和間甲酚的特性研究[J]. 中國給水排水，2013，21：97-99.

[9] 白靜. 糞產(chǎn)堿桿菌降解苯酚、間甲酚的特性及其動力學研究[D]. 天津：天津大學，2006.

[10] Bai Jing，Wen Jianping，Li Hongmei，et al. Kinetic modeling of growth and biodegradation of phenol and m-cresol using Alcaligenes faecalis[J]. Process Biochemistry，2007，42 ：510-517.

[11] 彭麗花，任源，鄧留杰，等. 間甲酚降解菌Citrobacter farmeri 的降解特性及代謝途徑解析[J]. 環(huán)境化學，2009（1）：44-48.

[12] 吳坤，徐淑霞，閔航，等. 間甲酚對雜色云芝（Coriolus versicolor）生長及產(chǎn)漆酶能力的影響[J]. 環(huán)境科學學報，2004，06：1135-1141.

[13] Arutchelvan V，Kanakasabai V，Elangovan R，et al．Kinetics of high strength phenol degradation using Bacillus brevis [J]. Journal of Hazardous Materials，2006，129（1-3）：216-222．

[14] 袁利娟，姜立春，彭正松，等.高效降酚菌Bacillus sp．JY01 的固定化及降解特性研究[J]. 環(huán)境科學與技術(shù)，2010，33（4）：49 - 52，56．

[15] 李淑彬，陳振軍，丘李莉，等. 蠟狀芽孢桿菌菌株 Jp-A 的分離鑒定及其降解苯酚特性[J]．應用生態(tài)學報，2006，17（5） ：920-924.

[16] 于彩虹，陳飛，胡琳娜，等. 一株苯酚降解菌的篩選及降解動力學特性[J]. 環(huán)境工程學報，2014（3）：1215-1220.

[17] Jiang Yan，Wen Jianping，Bai Jing，et al. Phenol biodegradation by the yeast Candida tropicalis in the presence of m-cresol[J]. Biochemical Engineering Journal，2006，29：227-234.

[18] Kampfer P，Rossello-Mora R，Scholz HC，et al. Description of Pseudochrobactrum gen. nov. ， with the two species Pseudochrobactrum asaccharolyticum sp. Nov. and Pseudochrobactrum saccharolyticum sp. nov.[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2006，56：1823-1829.