豬仔笠黃酮類化合物的提取工藝及其穩(wěn)定性

謝勇平 ,李清祿 ,應(yīng)順秋

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ,福建福州350002)

豬仔笠黃酮類化合物的提取工藝及其穩(wěn)定性

謝勇平 ,李清祿 ,應(yīng)順秋

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ,福建福州350002)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上 ,通過(guò)正交試驗(yàn) ,確認(rèn)豬仔笠黃酮類化合物的最佳提取工藝為:乙醇含量45%、料液比1∶30、提取溫度70℃、提取時(shí)間4 h.探討光照、加熱、pH和存放時(shí)間對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響.結(jié)果表明:豬仔笠黃酮類化合物在暗室和室內(nèi)自然光照下較穩(wěn)定 ,室外強(qiáng)光照下其含量明顯下降；加熱對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響不明顯；pH對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響較大 ,在pH為5－6時(shí)的穩(wěn)定性最好；豬仔笠黃酮類化合物可存放一定時(shí)間 ,暗室內(nèi)存放60 d ,黃酮類化合物保存率為98.32%.

豬仔笠；黃酮類化合物；提取工藝；穩(wěn)定性

黃酮類化合物是廣泛存在于水果、蔬菜和中草藥中的一種重要的天然有機(jī)化合物 ,是一種植物多酚次生代謝產(chǎn)物 ,在植物體內(nèi)少數(shù)以游離形式存在 ,大部分與糖結(jié)合成苷.大量研究表明 ,黃酮類化合物不僅具有抑菌、抗氧化、保肝、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用 ,而且在治療心血管疾病和抗腫瘤等方面具有一定的療效[1－6].

植物黃酮類化合物的提取方法主要有醇類提取法、熱水提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法和微波加熱提取法等.超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法和微波加熱提取法具有提取率高和產(chǎn)品活性高的優(yōu)點(diǎn) ,但無(wú)法大規(guī)模提取 ,同時(shí)生產(chǎn)成本高 ,難以工業(yè)化生產(chǎn)；醇類提取法和熱水提取法雖耗時(shí)長(zhǎng) ,但提取率和產(chǎn)品純度均相對(duì)較高 ,同時(shí)操作簡(jiǎn)單 ,易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模提取.因此 ,工業(yè)提取黃酮類化合物多采用這兩種方法.

不同植物來(lái)源的黃酮提取物 ,所含成分的種類和含量各不相同 ,因此在各種條件下的穩(wěn)定性也不同.探討黃酮提取物在不同條件下的穩(wěn)定性 ,對(duì)黃酮產(chǎn)品的加工和存放、質(zhì)量控制等方面具有重要的指導(dǎo)意義.如探討光照對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響 ,可以選擇儲(chǔ)存黃酮產(chǎn)品的材質(zhì)(馬口鐵罐、透明玻璃瓶或是棕色玻璃瓶)；探討加熱對(duì)穩(wěn)定性的影響 ,可以判斷加工過(guò)程是否可以有適當(dāng)?shù)臒崽幚?

豬仔笠(Eriosema chinense Vog.)為豆科毛瓣花屬植物 ,約100種 ,分布于熱帶和亞熱帶地區(qū).據(jù)?中藥大詞典?記載:豬仔笠塊根入藥 ,具有清熱解毒、生熱煩渴、化痰潤(rùn)肺、止咳之功效 ,是治療傷風(fēng)咳嗽、上呼吸道感染、發(fā)熱煩渴、痢疾、跌打損傷等疾病的珍稀名貴中草藥.豬仔笠雖然已在民間應(yīng)用較廣 ,但對(duì)其黃酮成分的提取、穩(wěn)定性以及生物活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的醇類提取法 ,以黃酮類化合物提取量為考察指標(biāo) ,通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)豬仔笠黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選 ,并探討光照、加熱、pH和存放時(shí)間對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響 ,旨在為豬仔笠的有效開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 豬仔笠購(gòu)自福建龍巖 ,由福建省中醫(yī)藥研究院王振登研究員鑒定；蘆丁對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；石油醚為AR ,沸程60－90℃；無(wú)水乙醇、乙酸丁酯、正丁醇、AlCl3、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH和濃硫酸均為AR.

1.1.2 儀器 主要儀器有電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、BS210S型微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)、粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)、循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海國(guó)華儀器設(shè)備有限公司)、恒溫循環(huán)器(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、Cary50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)VARIAN公司)和ZF-1型三用紫外分析儀(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司).

1.2 豬仔笠黃酮類化合物的提取工藝

1.2.1 黃酮類化合物的提取 豬仔笠塊根用蒸餾水洗滌 ,置于60℃的干燥箱中恒溫烘干24 h ,取出后粉碎.稱取5.0 g塊根粉末用一定體積不同含量的乙醇恒溫加熱回流一定時(shí)間 ,連續(xù)提取3次.收集合并提取液 ,經(jīng)減壓過(guò)濾濃縮至干 ,得棕色膏狀提取物.加入20 mL蒸餾水混懸 ,用20 mL石油醚(60－90℃)依次萃取3次除去脂類物質(zhì) ,取下層清夜收集合并 ,再經(jīng)減壓蒸餾 ,得粗黃酮提取物 ,加入70%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中 ,備用.

1.2.2 黃酮類化合物含量的測(cè)定 采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH法[7]測(cè)定 ,參照文獻(xiàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定豬仔笠黃酮類化合物的含量.

1.2.3 單因素試驗(yàn) 在提取條件的選擇中 ,以豬仔笠黃酮類化合物的提取量為衡量指標(biāo) ,提取溶劑為乙醇 ,選取提取溫度、乙醇含量、提取時(shí)間和料液比4個(gè)主要因素 ,分析它們對(duì)黃酮類化合物提取量的影響.

1.2.4 正交試驗(yàn) 以豬仔笠黃酮類化合物的提取量為分析指標(biāo) ,采用乙醇作為提取溶劑 ,以提取溫度、乙醇含量、提取時(shí)間和料液比作為考察因素 ,在各因素最佳值的附近分別選取3個(gè)水平 ,根據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì) ,作4因素3水平正交試驗(yàn) ,以確定黃酮類化合物的最佳提取工藝.采用直觀分析方法 ,依據(jù)極差大小和方差分析確定提取條件的主次順序.

1.3 豬仔笠黃酮類化合物的穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.1 光照的影響 將制備的黃酮類化合物提取液高壓蒸汽滅菌20 min ,測(cè)定黃酮類化合物含量后蠟封 ,分別置于暗室、室內(nèi)自然光照和室外強(qiáng)光照(每天光照6 h)下 ,每隔1 d測(cè)定黃酮類化合物含量 ,每個(gè)樣品重復(fù)3次 ,連測(cè)5 d.

1.3.2 加熱的影響 將黃酮類化合物提取液分別在60、70、80、90和100℃加熱30 min ,測(cè)定黃酮類化合物含量 ,每個(gè)樣品重復(fù)3次.

1.3.3 pH的影響 用4%NaOH和10%H2SO4調(diào)節(jié)黃酮類化合物提取液的pH ,pH分別配制為2、3、4、5、6、7、8、9和10 ,靜置30 min后測(cè)定黃酮類化合物含量 ,每個(gè)樣品重復(fù)3次.

1.3.4 存放時(shí)間的影響 將黃酮類化合物提取液高壓蒸汽滅菌20 min ,測(cè)定黃酮類化合物含量后蠟封 ,置于暗室 ,每隔10 d測(cè)定黃酮類化合物含量 ,共測(cè)定60 d ,每個(gè)樣品重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以光密度(D)對(duì)蘆丁含量(C)作回歸處理得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1) ,回歸方程:D＝18.4570C－0.0004(R2＝0.9997).

2.2 單因素對(duì)豬仔笠黃酮類化合物提取工藝的影響

2.2.1 乙醇含量的影響 分別以35%、45%、55%、65%和75%乙醇為提取溶劑 ,在料液比為1∶30 ,提取溫度為80℃的條件下提取3 h ,乙醇含量對(duì)豬仔笠黃酮類化合物提取量的影響見(jiàn)圖2.

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

圖2 乙醇含量對(duì)黃酮類化合物提取效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield

圖2表明 ,隨著乙醇含量的增加 ,黃酮類化合物的提取量先升高后降低 ,提取量最高點(diǎn)出現(xiàn)在乙醇含量為55%的時(shí)候 ,當(dāng)乙醇含量繼續(xù)增加時(shí) ,黃酮類化合物提取量開(kāi)始下降.一方面可能是由于含量為55%的乙醇的極性與豬仔笠黃酮類化合物的極性最相似 ,黃酮類化合物的溶解度最大；另一方面也可能是隨著乙醇含量的增加 ,醇溶性雜質(zhì)溶出量增多 ,與黃酮類化合物爭(zhēng)奪溶劑 ,導(dǎo)致黃酮類化合物提取量降低.因此 ,提取溶劑宜選取含量為55%的乙醇.

2.2.2 提取時(shí)間的影響 以55%乙醇為提取溶劑 ,在料液比為1∶30 ,提取溫度為80℃的條件下分別提取1、2、3、4和5 h ,提取時(shí)間對(duì)豬仔笠黃酮類化合物提取量的影響見(jiàn)圖3.

圖3表明 ,提取時(shí)間從1 h增加至3 h ,黃酮類化合物提取量迅速增加 ,但隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加 ,黃酮類化合物提取量的增加趨勢(shì)變得緩慢.綜合考慮黃酮類化合物提取量和節(jié)約能源的需要 ,確定最佳的提取時(shí)間為3 h.

2.2.3 料液比的影響 以55%乙醇為提取溶劑 ,在料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 ,提取溫度為80℃的條件下提取3 h ,料液比對(duì)豬仔笠黃酮類化合物提取量的影響見(jiàn)圖4.

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield

圖4 料液比對(duì)黃酮類化合物提取效果的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield

圖4表明 ,黃酮類化合物提取量隨著溶劑的增多逐漸增加 ,這是由于溶劑用量的增加 ,有利于黃酮類化合物由原料向浸提液擴(kuò)散.剛開(kāi)始隨著溶劑用量的增加 ,黃酮類化合物提取量迅速增加 ,在料液比達(dá)到1∶30后 ,繼續(xù)增加溶劑用量 ,黃酮類化合物提取量的增加趨勢(shì)變得緩慢.基于提取量和節(jié)省溶劑的雙重考慮 ,選擇最佳的料液比為1∶30.

2.2.4 提取溫度的影響 以55%乙醇為提取溶劑 ,在料液比為1∶30 ,提取溫度分別為50、60、70、80和90℃的條件下提取3 h ,提取溫度對(duì)豬仔笠黃酮類化合物提取量的影響見(jiàn)圖5.

圖5表明 ,提取溫度從50℃升高至80℃ ,黃酮類化合物提取量逐漸增加.一方面是由于提取溫度越高 ,黃酮類化合物在提取溶劑中的溶解度越大；另一方面 ,溫度升高 ,分子熱運(yùn)動(dòng)加劇 ,擴(kuò)散、滲透速度加快 ,黃酮類化合物更容易從植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移到提取溶劑中.當(dāng)溫度高于80℃時(shí) ,黃酮類化合物提取量降低 ,可能是由于部分黃酮類化合物在高溫下不穩(wěn)定 ,被氧化破壞 ,同時(shí)高溫下雜質(zhì)的溶出量增多 ,對(duì)后續(xù)的萃取操作造成一定的影響.綜上所述 ,選擇最佳的提取溫度為80℃.

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果 ,確定正交試驗(yàn)的因素和水平如表1所示.

圖5 提取溫度對(duì)黃酮類化合物提取效果的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction yield

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

根據(jù)選擇的因素和水平作L9(34)正交試驗(yàn) ,結(jié)果見(jiàn)表2.由表2的R可以看出 ,正交試驗(yàn)所考察的影響豬仔笠黃酮類化合物提取量的4個(gè)因素中 ,影響主次關(guān)系為:提取時(shí)間(D)>料液比(B)>乙醇含量(A) >提取溫度(C).方差分析結(jié)果(表3)表明 ,提取時(shí)間和料液比對(duì)黃酮類化合物提取量有顯著影響.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析1)Table 3 Variance analysis of the orthogonal test

綜合考慮確認(rèn)豬仔笠黃酮類化合物的最佳提取因素水平組合為A1B2C1D3,即乙醇含量為45% ,料液比為1∶30 ,在70℃下提取4 h.

2.4 4個(gè)因素對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響

2.4.1 光照的影響 從光照對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響(圖6)可以看出 ,無(wú)論是暗室、室內(nèi)自然光照 ,還是室外強(qiáng)光照下 ,隨著時(shí)間的推移 ,黃酮類化合物均會(huì)逐漸降解.其中 ,于暗室降解最慢 ,5 d后的保存率達(dá)到99.82%；其次在室內(nèi)自然光照下 ,5 d后的保存率為98.25%；室外強(qiáng)光照對(duì)黃酮類化合物有較強(qiáng)的降解作用 ,5 d后的保存率僅為91.74%.可見(jiàn) ,豬仔笠黃酮類化合物在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中應(yīng)避免強(qiáng)光照射.

圖6 光照對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of illumination on stability of the flavonoids from E.chinense

2.4.2 加熱的影響 從加熱對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響(圖7)可以看出 ,加熱會(huì)導(dǎo)致黃酮類化合物降解 ,溫度越高 ,降解程度越大.總體來(lái)看 ,在100℃下加熱半小時(shí)后的保存率最低 ,為97.42% ,表明豬仔笠黃酮類化合物對(duì)溫度不太敏感 ,比較穩(wěn)定.

2.4.3 pH的影響 從pH對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響(圖8)可以看出 ,pH對(duì)黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響較大.pH為5－6時(shí)最穩(wěn)定 ,尤其在pH為6時(shí) ,保存率高達(dá)99.62%；pH太高或太低對(duì)黃酮類化合物的穩(wěn)定性都不利 ,尤其在pH為10時(shí) ,保存率僅為67.84%.

圖7 加熱對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of heating on the stability of flavonoids from E.chinense

圖8 pH對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on the stability of flavonoids from E.chinense

2.4.4 存放時(shí)間的影響 從暗室存放時(shí)間對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響(圖9)可以看出 ,隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng) ,黃酮類化合物緩慢降解 ,60 d后的保存率為98.32%.表明豬仔笠黃酮類化合物比較穩(wěn)定 ,可以在暗室存放一定時(shí)間.

3 討論

(1)天然產(chǎn)物有效成分提取常用的優(yōu)化方法有單因素分析法和正交設(shè)計(jì)分析法.本試驗(yàn)對(duì)豬仔笠黃酮類化合物的提取條件作4因素3水平的正交試驗(yàn) ,可在一定程度上克服了單因素分析法和正交設(shè)計(jì)分析法各自的局限性 ,最終確定最佳的提取工藝為:采用回流提取法 ,以45%乙醇為提取溶劑 ,在料液比為1∶30 ,提取溫度為70℃的條件下提取4 h.影響豬仔笠黃酮類化合物提取量的4個(gè)因素中 ,影響主次關(guān)系為:提取時(shí)間>料液比>乙醇含量>提取溫度.方差分析結(jié)果表明 ,提取時(shí)間和料液比對(duì)豬仔笠黃酮類化合物提取量有顯著影響.

(2)黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的黃色色素 ,不同植物來(lái)源的黃酮提取物受光照影響較大[8－10].本試驗(yàn)結(jié)果表明 ,在室外強(qiáng)光照下 ,豬仔笠黃酮類化合物發(fā)生較強(qiáng)的降解作用 ,因此 ,豬仔笠黃酮類化合物在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中應(yīng)避免強(qiáng)光直照.不同植物來(lái)源的黃酮提取物 ,所含成分的種類和含量各不相同 ,對(duì)溫度的敏感性也不同.側(cè)柏葉黃酮在溫度大于50℃時(shí)就明顯降解[11]；野菊花黃酮在100℃下加熱30 min ,黃酮含量穩(wěn)定[9].本試驗(yàn)結(jié)果表明 ,豬仔笠黃酮類化合物對(duì)溫度不太敏感 ,比較穩(wěn)定 ,在生產(chǎn)中可以進(jìn)行熱處理 ,但處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng).pH是黃酮穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素 ,不同植物來(lái)源的黃酮提取物一般在酸性條件下穩(wěn)定 ,中性和堿性條件下不穩(wěn)定 ,均有各自適合的pH.如桑白皮黃酮在pH為2.2－6下較穩(wěn)定[8],野菊花黃酮在pH為3.9－5.9下較穩(wěn)定[9].本試驗(yàn)結(jié)果表明 ,豬仔笠黃酮類化合物的適宜pH為5－6 ,此時(shí)黃酮類化合物含量最高 ,最穩(wěn)定.豬仔笠黃酮類化合物在暗室中降解緩慢 ,因此可以在暗室中儲(chǔ)存一定時(shí)間.

圖9 暗室存放時(shí)間對(duì)豬仔笠黃酮類化合物穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of stored time on the stability of flavonoids from E.chinense

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

The extraction and stability of flavonoids from Eriosema chinense

XIE Yong-ping ,LI Qing-lu ,YING Shun-qiu
(College of Life Science ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

Experiments were carried out to study the optimal extraction condition of flavonoids from Eriosema chinense Vog.using four-factor-five-level orthogonal design.The study investigated key factors including ethanol content(35%－75%) ,extraction dura-tion(1－5 h) ,material-liquid ratio(1∶10－1∶50) ,extraction temperature(50－90℃).Results implied that the optimal extrac-tion parameter was to set material-liquid ratio at 1∶30 with 45%ethanol and be extracted at 70℃for 4 h.Stability of flavonoids was discussed by examining parameters such as light ,heat ,pH and stored time.Results showed that flavonoids from E.chinense were more stable in dark than illuminated conditions.Flavonoids content dropped to 91.74%in bright outdoor in 5 days ,compared with 99.82%in darkroom.pH greatly affected stability of flavonoid with pH 5－6 being the optimal storage acidity.Heat and store time ex-hibited less effect on the stability of flavonoids than the other two parameters.Flavonoids content remained at 98.32%after 60 days in darkroom.

Eriosema chinense；flavonoids；extraction technology；stability

TQ28

A

1671-5470(2015)06-0612-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.009

2015－04－12

2015－06－02

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013J01360)；福建省教育廳B類科技項(xiàng)目(JB12052).

謝勇平(1978－) ,男 ,講師 ,碩士.研究方向:天然產(chǎn)物活性成分提取.Email:xypnm＠163.com.通訊作者李清祿(1957－) ,男 ,教授.研究方向:天然產(chǎn)物活性成分提取.Email:lql3388＠126.com.