雌激素缺乏上調(diào)大鼠腎臟腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)

潘 海，李曉敏，張 巖

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究中心， 上海 200093)

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雌激素缺乏上調(diào)大鼠腎臟腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)

潘 海，李曉敏，張 巖*

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究中心， 上海 200093)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)在慢性腎病(chronic kidney disease, CKD)發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，血管緊張素Ⅱ(angiotensin, AngⅡ)作為RAS的主要生物活性物質(zhì)通過(guò)升高腎小體血管血壓，造成腎小體血管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞的損傷，誘導(dǎo)CKD的發(fā)生。腎素在RAS中扮演蛋白水解酶作用，此外，腎素(原)還能與其受體結(jié)合直接誘導(dǎo)炎性反應(yīng)和增生肥厚效應(yīng)。

對(duì)去卵巢大鼠研究發(fā)現(xiàn)[1]，去卵巢2周后腎臟血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)活性上升，雌激素替代治療能抑制ACE的酶活性，雌激素可能通過(guò)抑制ACE的mRNA表達(dá)來(lái)減弱大鼠腎臟ACE的活性。臨床研究表明，絕經(jīng)后女性血漿腎素活性(plasma renin activity, PRA)升高[2]。說(shuō)明雌激素缺乏與腎素和ACE之間存在交互作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)去卵巢誘導(dǎo)大鼠雌激素缺乏，旨在闡明雌激素缺乏對(duì)腎局部合成AngⅡ的兩種重要酶腎素和ACE的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：鈣、磷和肌酐試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；Trizol試劑和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)；引物(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)；30%聚丙烯酰胺和Bradford蛋白定量試劑(Bio-rad公司)；一抗(Santa Cruz Biotechnology公司)；二抗(Bioworld Technology公司)。

1.2 大鼠分組及處理：SPF級(jí)雌性6周齡SD大鼠15只，體質(zhì)量200～220 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)。動(dòng)物合格證號(hào)：2007000524918。適應(yīng)飼養(yǎng)1周，取10只進(jìn)行去卵巢手術(shù)(OVX)，其余5只進(jìn)行假手術(shù)(sham)。OVX手術(shù)成功后隨機(jī)分為2組(OVX1和OVX2)。Sham和OVX1自由飲食喂養(yǎng)3周后處死，OVX2自由飲食喂養(yǎng)6周后處死，收集3組實(shí)驗(yàn)大鼠的血液、尿液和雙腎。

1.3 血清和尿液生化指標(biāo)測(cè)定：血清鈣(serum calcium, SCa)、血清磷(serum phosphorous, SP)、尿鈣(urine calcium, UCa)、尿磷(urine phosphorous, UP)和尿肌酐(urine creatinine, UCre)的檢測(cè)嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 RT-PCR檢測(cè)腎臟腎素和ACE的基因表達(dá)：采用Trizol一步法提取腎組織總mRNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作要求將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，測(cè)試管中分別加入相應(yīng)引物，按下列反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性15 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s。72 ℃終末延伸3 min，共30～40個(gè)循環(huán)，電泳40 min后在紫外燈下觀察結(jié)果。半定量分析：將電泳后的凝膠放于GeneSnap凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)量相關(guān)基因的吸光度值，分別與內(nèi)參基因吸光度的比值即為相關(guān)基因吸光度值的相對(duì)值。

1.5 腎臟腎素和ACE的蛋白表達(dá)：用含有蛋白酶抑制劑的Laemmli緩沖液于4 ℃裂解組織30 min，取上清液，Bradford試劑測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白100 ℃變性5 min，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜。5%(w/v)脫脂奶室溫封閉2 h，加封閉液稀釋的一抗4 ℃過(guò)夜，加熒光標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)1 h。β-actin為內(nèi)參照。采用Odyssey紅外激光雙色成像儀掃描成像，配套軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 生理生化指標(biāo): 去卵巢3周和6周后，大鼠體質(zhì)量(body weight, BW)明顯上升(P<0.05,P<0.01)。去卵巢3周尿磷升高(P<0.05)(表1)。

2.2 腎臟腎素和ACE的基因表達(dá):OVX2組腎素和ACE的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01,P<0.05)(圖1A, C)。

2.3 腎臟腎素和ACE的蛋白表達(dá):OVX1組腎素和ACE的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05,P<0.05)，OVX2組腎素和ACE的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05,P<0.01)(圖1B, C)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量、血鈣、血磷、尿鈣和尿磷數(shù)據(jù)Table 1 Date of BW, SCa, SP, UCa, and UP of rats in each group(±s, n= 5)

*P<0.05,**P<0.01 compared with sham group.

A.RT-PCR analysis of renin and ACE; B.Western blot analysis of renin and ACE; C.densitometric quantification;*P<0.05, **P<0.01 compared with sham group

3 討論

本研究結(jié)果顯示，雌激素缺乏導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂誘導(dǎo)大鼠體質(zhì)量增加。血清、尿液生化指標(biāo)無(wú)顯著差異，說(shuō)明去卵巢早期引起的雌激素缺乏對(duì)腎的生理功能無(wú)明顯影響。去卵巢引起的內(nèi)源性雌激素缺乏能誘導(dǎo)腎臟腎素和ACE過(guò)表達(dá)，說(shuō)明絕經(jīng)前內(nèi)源性雌激素對(duì)腎臟局部RAS的活性具有抑制作用。

性別差異可能影響腎臟的功能。對(duì)單側(cè)腎切除大鼠研究發(fā)現(xiàn)，雄激素能促進(jìn)雄性大鼠另側(cè)腎的生長(zhǎng)，但是在雌性大鼠中沒(méi)有發(fā)生腎小球和腎小管損傷，說(shuō)明內(nèi)源性雌激素對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。更深入的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素對(duì)老齡、糖尿病及其并發(fā)癥、非糖尿病腎病、急性或慢性缺血誘導(dǎo)的腎損傷具有保護(hù)作用[2]。

有趣的是，對(duì)雌激素受體(estrogen receptor, ER)在腎內(nèi)分布的研究發(fā)現(xiàn)，ER在全腎、系膜細(xì)胞和JG細(xì)胞的表達(dá)水平較低[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的缺乏能上調(diào)腎素基因和蛋白在全腎中的表達(dá)。這說(shuō)明雌激素可能通過(guò)間接方式，而不是直接與受體結(jié)合介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄影響腎素的合成。對(duì)去卵巢大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的替代治療能降低腎局部ACE的活性和ACE的mRNA表達(dá)[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素缺乏能同時(shí)上調(diào)腎臟ACE的mRNA和蛋白表達(dá)。雌激素-ER復(fù)合體與雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element, ERE)結(jié)合影響RNA聚合酶活性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。然而，在ACE的5′編碼區(qū)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ERE，但是它的啟動(dòng)子上游區(qū)域有一個(gè)300bp的核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白- 1(activator protein, AP- 1)的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)[3]，c-Fos(AP- 1的組成元件)基因沉默能下調(diào)雌激素介導(dǎo)的E2F1和cAMP依賴性的蛋白激酶抑制劑-β的基因表達(dá)，說(shuō)明AP- 1在雌激素介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。因此，我們推測(cè)在腎臟中AP- 1位點(diǎn)可能是雌激素-ER復(fù)合體調(diào)控ACE轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)之一。

雌激素對(duì)腎局部腎素和ACE的合成與分泌的作用機(jī)制可能不同。本研究結(jié)果首次報(bào)道了去卵巢早期，內(nèi)源性雌激素的缺乏能同時(shí)上調(diào)腎素、ACE的基因、蛋白在腎局部的表達(dá)。然而，雌激素對(duì)腎素和ACE的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

[1] Dean SA, Tan J, O’Brien ER,etal. 17β-Estradiol downregulates tissue angiotensin-converting enzyme and ANG Ⅱ type 1 receptor in female rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2005, 288: 759- 766.

[2] Castrop H, H?cherl K, Kurtz A,etal. Physiology of kidney renin[J]. Physiol Rev, 2010, 90: 607- 673.

[3] Dahlman-Wright K, Qiao Y, Jonsson P,etal. Interplay between AP- 1 and estrogen receptor α in regulating gene expression and proliferation networks in breast cancer cells. Carcinogenesis, 2012, 33: 1684- 1691.

科普沙龍

抗抑郁藥研究的最佳途徑

目前，抗抑郁治療是通過(guò)增加突觸的單氨神經(jīng)遞質(zhì)分子(monoamine neurotransmitter molecules)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是一旦用抗壓力藥物開(kāi)始治療，單氨基水平就會(huì)迅速改變，而且這些藥通常需要幾周的時(shí)間才能發(fā)揮臨床治療效果。然而，盡管它們對(duì)一些患者有效，而對(duì)另一些患者，尤其是自殺傾向性最高的患者，這些藥通常是無(wú)效的。這就強(qiáng)烈地提示，需要研制作用快速的不良反應(yīng)小的抗抑郁治療方法。一些研究人員目前正在動(dòng)物體內(nèi)模擬類似抑郁特征并用來(lái)作研究，目的是要識(shí)別出神經(jīng)環(huán)路機(jī)制。然而，最近美國(guó)的一位神經(jīng)科學(xué)家認(rèn)為，提高藥效的更好的方法是應(yīng)闡明可增強(qiáng)治療效果并快速作用的抗抑郁藥物的生物學(xué)機(jī)制。

使用動(dòng)物模型來(lái)研究抑郁癥，當(dāng)前很大程度人們將研究焦點(diǎn)放在行為測(cè)試上，例如，壓力反應(yīng)；或嘗試去模擬和測(cè)量病癥的一些反應(yīng)與“表現(xiàn)”，例如無(wú)助或缺乏快感(不能體會(huì)到快樂(lè))。但是本文作者認(rèn)為，應(yīng)用這些動(dòng)物模型須小心謹(jǐn)慎，因?yàn)椴⒉磺宄鼈兊男袨楸憩F(xiàn)與人類行為是否相一致。然而，它們的應(yīng)用對(duì)于開(kāi)展有關(guān)導(dǎo)致抑郁的生理學(xué)異常改變(病理生理學(xué))，乃至治療選擇的建設(shè)性討論，無(wú)疑是有價(jià)值的。

盡管使用動(dòng)物模型中有積極方面，但作者認(rèn)為，最直接的辦法是對(duì)提高療效的機(jī)制理解，這才是最好的出路。這一途徑在成癮藥物研究方面證實(shí)是成功的，例如對(duì)可卡因的生物作用機(jī)制的研究。人們不僅對(duì)潛在治療，而且對(duì)成癮藥物治療的神經(jīng)環(huán)路有更深入的了解。此外，由于抗抑郁藥須在服藥后一定時(shí)間才發(fā)揮它們的療效，因此對(duì)它們的研究比較困難。因此，作用快的、低劑量氯胺酮能促進(jìn)一個(gè)快速抗抑郁反應(yīng)，而且對(duì)那些有治療拮抗的抑郁患者也有效，這可為抑郁治療提供一個(gè)寶貴的治療途徑。

迄今已進(jìn)行有關(guān)氯胺酮的臨床測(cè)試，用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物體內(nèi)分析生物學(xué)機(jī)制，已識(shí)別出氯胺酮的標(biāo)靶(神經(jīng)遞質(zhì)分子谷氨酸的一個(gè)受體蛋白)、同時(shí)發(fā)現(xiàn)氯胺酮對(duì)這一受體的阻滯與一種特定單一路徑的改變相關(guān)聯(lián)，這些改變可能導(dǎo)致強(qiáng)化藥物迅速起效的突觸效應(yīng)。

這一發(fā)現(xiàn)使我們更加了解氯胺酮的作用機(jī)制，并且有助于鑒定有類似作用機(jī)制的藥物，尤其是從這一反轉(zhuǎn)錄途徑得到的信息表明，抗抑郁反應(yīng)以一種不同于一些經(jīng)典抗抑郁藥物的作用方式所引發(fā)。這一發(fā)現(xiàn)將最終突破了以往只是增加突觸單胺水平的方法。

因?yàn)檫@類疾病很可能由諸多不同的因素所導(dǎo)致，因此使用動(dòng)物去模擬神經(jīng)失調(diào)有很多問(wèn)題。但是如果生物機(jī)制一旦被闡明，動(dòng)物模型可用來(lái)測(cè)試基因多樣性，因?yàn)橥ǔ；蚨鄻有耘c復(fù)雜性神經(jīng)失調(diào)相聯(lián)系，例如抑郁癥。

擇句翻譯：

Nonetheless, their use has been undeniably valuable for developing a constructive debate about the abnormal changes in physiology (the pathophysiology) that lead to depression and, by extension, about treatment options.

然而，它們的應(yīng)用對(duì)于開(kāi)展有關(guān)導(dǎo)致抑郁的生理學(xué)異常改變(病理生理學(xué))，乃至治療選擇的建設(shè)性討論，無(wú)疑是有價(jià)值的。

章靜波 審校

2014- 06- 20

：2014- 07- 17

上海市教委科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(11ZZ137)

*通信作者(correspondingauthor)：medicineyan@usst.edu.cn

1001-6325(2015)02-0234-03

R 966

：A

??文 編譯自Nature， 515,200- 201.

10.1038/515200a