代謝綜合征大鼠腸系膜動脈eNOS磷酸化水平的變化

丁 菁，陸德琴，楊 飛，王勝男，張 倩

(貴陽醫(yī)學院 病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

?

代謝綜合征大鼠腸系膜動脈eNOS磷酸化水平的變化

丁 菁，陸德琴*，楊 飛，王勝男，張 倩

(貴陽醫(yī)學院 病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)主要表現腹型肥胖、血脂異常、高血壓及糖代謝紊亂等，均可導致血管內皮功能紊亂(endothelial cell dysfunction, ECD)。ECD是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理學基礎，而eNOS/NO功能障礙又是ECD的發(fā)生關鍵環(huán)節(jié)。本研究復制MS大鼠模型，觀察MS發(fā)生發(fā)展過程中體循環(huán)小血管(腸系膜動脈)eNOS/NO及PI3K/Akt信號通路的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組：清潔級雄性SD大鼠96只，體質量140～160 g[重慶騰鑫生物技術有限公司，動物合格證序號SCXK(渝)2007- 0005]。大鼠隨機分為對照組(control)及代謝綜合征組(MS)8，16和20周組(n=16)。

1.2 主要試劑：兔抗eNOS Ser1177抗體(Millipore公司)，兔抗eNOS Ser633抗體、Akt抗體、Akt Ser473抗體、Akt Thr308抗體(Cell Signaling公司)，兔抗eNOS抗體、β-tubulin抗體及HPR標記的羊抗兔IgG(Santa Cruz公司)；大鼠胰島素酶聯免疫定量檢測試劑盒(上海鑫樂)；一氧化氮(NO)檢測試劑盒(Calbiochem公司)。

1.3 代謝綜合征模型的復制與評定：大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，參考文獻[1]的方法復制MS大鼠模型。參照2005年國際糖尿病聯盟(the international diabetes federation, IDF)頒布的MS定義，在中心性肥胖基本上合并三酰甘油(triglycerides, TG)升高、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)降低、高血壓及高血糖/胰島素抵抗4項中2項及以上者評定為模型復制成功。

1.4 標本的采集：取大鼠(禁食8 h)腸系膜動脈于液氮中凍凝，置-70 ℃冰箱保存。

1.5 檢測指標及方法：每周監(jiān)測大鼠體質量、空腹尾靜脈血糖，取材時取股動脈血送貴醫(yī)附院生化科檢測血糖、TG、HDL-C、總膽固醇(cholesterol, CHOL)及LDL-C水平；監(jiān)測大鼠尾動脈血壓，4周1次(每次測量3次，取平均值為當天血壓。造模后血壓較自身造模前升高≥15 mmHg者判定為血壓增高)；試劑盒檢測血胰島素。Western blot法檢測血管中eNOS、eNOS Ser1177及Ser633，Akt、Akt Ser473及Thr308蛋白表達。硝酸還原酶法檢測NO2-/NO3-的量以間接反映NO含量。

2 結果

2.1 MS模型復制情況：高脂高鹽飼料喂養(yǎng)4周后大鼠精神狀態(tài)較差、活動減少。MS- 8、16周及20周組所有大鼠體質量及血胰島素水平均較同時間點control組增高(P<0.05)，部分大鼠發(fā)生脂質代謝紊亂和血壓升高，且隨病程發(fā)展逐漸加重。各組空腹血糖無明顯差異。根據MS判定標準，模型復制成功例數分別為：8周組14只，16周組15只、20周組14只。未達MS判定標準的大鼠全部剔除。隨機從各組取12只大鼠完成后續(xù)試驗。

2.2 MS大鼠腸系膜動脈eNOS蛋白、磷酸化水平及NO的變化：

2.2.1 eNOS蛋白表達及eNOS Ser1177、eNOS Ser633位點磷酸化水平：與同時間點control組比較，MS- 8周組eNOS蛋白表達及eNOS Ser1177、Ser633磷酸化水平明顯增高(P<0.05)；MS- 20周組eNOS1177、Ser633磷酸化水平較control組明顯降低 (P<0.05)。MS- 16周組與control- 16周組eNOS蛋白表達及其磷酸化水平均無明顯差異(圖1)。

2.2.2 組織NO含量變化：與同時間點control組比較，MS- 8周組腸系膜動脈中NO含量明顯增高 (P<0.05)；MS- 16周組無明顯差異；MS- 20周組NO含量明顯降低(P<0.05)(表1)。

2.3 MS大鼠腸系膜動脈Akt蛋白及其磷酸化的變化:與同時間點control組相比，MS- 8周組腸系膜動脈中Akt Ser308及Akt Ser473磷酸化水平增高(P<0.05)；MS- 20周組Akt Ser308磷酸化水平降低(P<0.05)。MS- 16周組與control- 16周組Akt蛋白表達及其磷酸化水平均無明顯差異(圖2)。

*P<0.05 compared with same point of control group圖1 各組大鼠腸系膜動脈eNOS蛋白表達及eNOS Ser633 and eNOS Ser1177位點磷酸化水平Fig 1 Protein expression of eNOS, eNOS Ser633 and eNOS Ser1177 in mesenteric arteries of each group

*P<0.05 compared with same point of control group圖2 各組大鼠腸系膜動脈中Akt蛋白表達及Akt Thr308及Akt Ser473位點磷酸化水平Fig 2 Protein expression of Akt, Akt Thr308, Akt Ser473 in mesenteric arteries of each group

表1 腸系膜動脈NO含量

*P<0.05 compared with same point of control group.

3 討論

研究發(fā)現，eNOS基因敲除小鼠出現了類似人類MS的疾病表現，予以這些小鼠含硝酸鹽的飼料喂養(yǎng)后病情得以逆轉[2]，說明eNOS/NO在MS發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。目前認為，胰島素抵抗(insulin resistant, IR)是MS的發(fā)病核心。PI3K依賴性的信號通路受損是IR的一個顯著特點。文獻報道，人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)短時間暴露于胰島素，Akt及eNOS磷酸化水平均有增加[3]。本研究結果提示，在MS早期，存在PI3K/Akt激活使eNOS/NO活化。但隨著病程發(fā)展，MS大鼠的血胰島素含量持續(xù)維持在高水平，導致IR發(fā)生，使PI3K/Akt信號通路受損，導致eNOS/NO功能障礙，ECD發(fā)生，又促進了MS的發(fā)生發(fā)展。

[1] 李建生, 趙敏, 余海濱,等. 代謝綜合征大鼠模型的建立與評價及増齡因素的影響[J]. 中國老年學雜志, 2005,25:1490- 1492.

[2] Carlstrom M, Larsen FK, Nystrom T,etal. Dietary inorganic nitrate reverses feat-ures of metabolic syndrome in endothelial nitric oxide synthase-deficient mice[J]. PNAS, 2012;107:17716- 17720.

[3] Madonna R, De Caterina R. De Caterina R. Prolonged exposure to high insulin impairs the endothelial PI3-kinase/Akt/nitric oxide signalling[J]. Thromb Haemost, 2009,101: 345- 350.

新聞點擊

飲食失調影響女性生育健康

據美國國家科學院院報(PNAS)網站(2013-10-28)報道，芬蘭赫爾辛基大學的一項研究指出：有飲食失調問題的女性較同年齡的女性不易懷孕。

這份研究由赫爾辛基大學與芬蘭國家健康福利協(xié)會共同進行。研究者收集并了1995至2010年這15年前往診所接受飲食失調治療的2 257位患者的就診資料，再與同樣年齡、性別與種族的9 028位受試者為對照組進行比較。

研究指出，最明顯可以看到的差異表現在厭食癥的患者身上，她們懷孕比例低于對照組50%。與同年齡的其他女性相比，患有暴食癥的女性在懷孕過程中流產的概率達3倍以上；食欲過剩的女性流產概率為正常人2倍以上。在接受暴食癥治療的女性當中，大約50%女性在懷孕后流產。

雖然這份研究并沒有對于飲食失調女性所面臨的生育問題提供一個因果關系，但根據過去的研究結果，生育健康出狀況確實可部分歸因于飲食不正常所引起。過瘦或過胖的身體狀況都與不孕、流產的風險增高有關。研究者同時提醒，飲食失調通常也和生理周期異常有關，這很可能使得避孕措施不足，導致非預期懷孕的發(fā)生。

同時，研究人員指出，即使知道飲食失調的女性易面臨生育問題，想要預防問題的發(fā)生，要對飲食失調的女性進行初期識別、提供有效措施與長期追蹤生理期周期等卻有其困難性。后續(xù)的相關研究已經開始進行，焦點將放在飲食失調與婦女懷孕、分娩的關系。

該研究刊登于《國際飲食失調》期刊(International Journal of Eating Disorders)

2014- 01- 16

：2014- 07- 15

貴州省科技廳國際合作項目[ 黔科通(2010)59號]

*通信作者(correspondingauthor)：dqlu91@hotmail.com

1001-6325(2015)02-0231-03

R 363

：A