β-NGF減輕H2O2對HUVECs的損傷

王 剛，周敬群

(三峽大學 附屬仁和醫(yī)院 心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443002)

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β-NGF減輕H2O2對HUVECs的損傷

王 剛，周敬群*

(三峽大學 附屬仁和醫(yī)院 心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443002)

血管內(nèi)皮細胞損傷被認為是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要病理原因之一，且多與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。因此，如何保護氧化損傷后血管內(nèi)皮細胞功能對于防治動脈粥樣硬化等心血管疾病具有重要意義。神經(jīng)生長因子β-NGF是一種多功能性神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以促進血管新生且與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)，但其對氧化損傷后血管內(nèi)皮細胞的作用及其機制尚未知[1]。因此本研究以人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)為研究對象，利用H2O2誘導(dǎo)其氧化損傷進而研究β-NGF對血管內(nèi)皮細胞的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料:人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)(中科院生化所)；重組β-NGF蛋白、雙氫羅丹明123、Annexin V/ PI凋亡試劑盒(Sigma公司)；TrkA、P75NTR、caspase-3抗體(Santa Cruz公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生研所)。

1.2 方法

1.2.1 MTT方法：取增殖期HUVECs，用100 μmol/L H2O2氧化損傷4 h，分3組：空白PBS對照(a組)、低濃度1 μmol/L β-NGF(b組)、高濃度10 μmol/L β-NGF(c組)。分別處理24及48 h后，MTT方法檢測各組細胞存活率。細胞存活率=A570(各處理組)/A570(未損傷組)×100%。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測:采用相同方法處理HUVECs。在各組細胞中加入1 μmol/L雙氫羅丹明123，流式細胞儀檢測各組HUVECs內(nèi)活性氧ROS變化情況。同時按照Annexin V/PI凋亡試劑盒說明檢測各組HUVECs凋亡率。

1.2.3 MDA、SOD、GSH檢測: 采用相同方法處理HUVECs。分別按照MDA、SOD、GSH試劑盒說明書檢測各組HUVECs中MDA、SOD和GSH活性及含量。

1.2.4 Western blot檢測: 提取各組細胞中的總蛋白。每組上樣30 μg總蛋白SDS-PAGE凝膠電泳后Western blot方法檢測酪氨酸激酶受體A(TrkA)、神經(jīng)營養(yǎng)素受體P75(P75NTR)、凋亡蛋白caspase-3的相對表達。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果:β-NGF可以明顯提升H2O2氧化損傷后HUVECs的細胞活力(圖1)。與PBS對照組相比，1、10 μmol/L β-NGF處理組中HUVECs細胞24及48 h存活率均顯著上升(P<0.05)。

*P<0.05 compared with PBS group圖1 MTT檢測HUVECs損傷后細胞活力Fig 1 The injury HUVECs cell viability detected by MTT

2.2 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果:H2O2誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生大量活性氧ROS，而β-NGF作用可以顯著減少H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后產(chǎn)生的ROS(P<0.05)(圖2A，表1)。同時，β-NGF可以顯著抑制H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后的細胞凋亡(P<0.05)(圖2B，表1)。

A:ROS; B:cell apoptosis, a.control, b.1 mol/L β-NGF, c.10 mol/L β-NGF圖2 流式細胞術(shù)檢測ROS和細胞凋亡Fig 2 The ROS and cell apoptosis detected by flow cytometry

表1 HUVECs中ROS和細胞凋亡率統(tǒng)計

*P<0.05 compared with control group.

2.3 MDA、SOD和GSH檢測結(jié)果:經(jīng)H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后，與PBS對照組相比，β-NGF組中細胞MDA含量顯著下降，而SOD、GSH活性均顯著上升(P<0.05)(表2)。

表2 MDA、SOD和GSHTable 2 Comparison of MDA, SOD, GSH (±s, n=5)

*P<00.05 compared with control group.

2.4 Western blot結(jié)果:與PBS對照組相比，β-NGF作用組細胞中TrkA表達水平顯著上升，而P75NTR表達水平無明顯變化。且隨著β-NGF作用濃度的升高，caspase-3的表達水平顯著下降(圖3，表3)。

a.control; b.1 μmol/L β-NGF; c.10 μmol/L β-NGF圖3 Western-blot檢測TrkA、p75NTR和caspase-3表達Fig 3 TrkA, p75NTR and caspase-3 expression detected by Western blot

3 討論

研究表明β-NGF可以刺激血管新生， 但其對血管損傷后的作用未見闡述[2]。本研究利用H2O2刺激HUVECs構(gòu)建血管內(nèi)皮細胞氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)β-NGF作用可以顯著提高損傷后HUVECs的細胞活力，抑制H2O2氧化損傷HUVECs內(nèi)產(chǎn)生的ROS和細胞凋亡，并降低MDA含量提升SOD和GSH活性，提示β-NGF能夠減少H2O2對HUVECs氧化損傷。

表3 TrkA、P75NTR和caspase-3蛋白相對表達

*P<00.05 compared with control group.

NGF與酪氨酸激酶受體A(TrkA)或神經(jīng)營養(yǎng)素受體P75(P75NTR)結(jié)合后發(fā)揮不同的信號功能，介導(dǎo)細胞凋亡蛋白caspase-3表達[3]。本研究發(fā)現(xiàn)β-NGF作用于H2O2損傷后HUVECs，細胞中TrkA受體表達顯著上升，而細胞凋亡caspase-3表達隨之顯著下降，但p75NTR受體表達變化不明顯。說明β-NGF對H2O2氧化損傷HUVECs的保護作用與TrkA受體有關(guān)，但具體作用機制仍需進一步研究。

[1] Wen Z, Wei Y, Li L,etal. The promotion of endothelial progenitor cells recruitment by nerve growth factors in tissue-engineered blood vessels[J]. Biomaterials, 2010, 31:1636-1645.

[2] 齊巖梅, 韓雅玲, 康建, 等. 神經(jīng)生長因子對體外培養(yǎng)的小鼠主動脈環(huán)血管新生的影響及TrkA的關(guān)鍵作用[J]. 心臟雜志, 2009, 21:33-37.

[3] Li JF, Shu JC, Tang SH,etal. β-Nerve growth factor attenuates hepatocyte injury induced by D-galactosamineinvitrovia TrkANGFR[J]. Mol Med Rep, 2013, 8: 813-817.

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WHI激素療法試驗不支持用于慢性病預(yù)防

據(jù)美國國家科學院院報(PNAS)網(wǎng)站(2013-10-21)報道，之前激素療法(HRT)被發(fā)現(xiàn)使用后的風險大于效益，婦女健康行動計劃(WHI)研究因而終止。臨床上還是有停經(jīng)婦女繼續(xù)使用，而有關(guān)長期使用對預(yù)防慢性病的風險效益則仍是個問題。日前一項美國研究分析兩個WHI激素療法研究，雖然對一部分的婦女HRT可以處理停經(jīng)出現(xiàn)的一些癥狀，但研究結(jié)果并不支持使用激素來預(yù)防慢性病。

這項研究分析包括在1993年加入研究的27 347位50～79歲美國停經(jīng)女性的資料，分為未切除子宮的女性合并接受結(jié)合型雌激素與合成黃體素制劑或安慰劑；已切除的接受結(jié)合型雌激素或安慰劑。前后者使用激素療法時間分別為5.6年及7.2年，停用后仍持續(xù)追蹤6～8年才結(jié)束。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時接受結(jié)合型雌激素與合成黃體素制劑，風險大于效益。風險包括增加心血管疾病、乳腺癌、腦卒中、肺栓塞，65歲以上發(fā)生失智、膽囊疾病及尿失禁風險；效益則是降低髖骨骨折、糖尿病及血管收縮癥狀。這些效益風險在停止使用后會漸漸消失，但增高的乳腺癌風險在研究追蹤期間內(nèi)并未下降。

只接受結(jié)合型雌激素者，風險效益狀況較為平衡，使用會增加腦卒中與靜脈栓塞風險，但骨折風險下降，停用后乳腺癌風險明顯下降，其余狀況無太大差異。

這樣的結(jié)果顯示研究證據(jù)不支持使用合并雌激素與黃體素或單獨雌激素以預(yù)防慢性病。

該研究刊登于新一期美國醫(yī)學會期刊(JAMA)。

2014- 08- 25

：2014- 12- 01

湖北省教育廳自然科學研究計劃重點項目(D20091308)

*通信作者(correspondingauthor)：Zhoujingqun-1@medmail.com.cn

1001-6325(2015)02-0228-03

R331

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