苦參堿通過(guò)下調(diào)SOCS3表達(dá)抑制支氣管哮喘大鼠炎性反應(yīng)并調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡

范臨夏，潘 輝，劉 華，蔡曦光，陳其章，閆麗萍，王小軍

(甘肅省人民醫(yī)院 呼吸科， 甘肅 蘭州 730000)

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苦參堿通過(guò)下調(diào)SOCS3表達(dá)抑制支氣管哮喘大鼠炎性反應(yīng)并調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡

范臨夏，潘 輝，劉 華*，蔡曦光，陳其章，閆麗萍，王小軍

(甘肅省人民醫(yī)院 呼吸科， 甘肅 蘭州 730000)

目的探討苦參堿減輕支氣管哮喘大鼠炎性反應(yīng)、糾正Th1/Th2失衡的作用，以及SOCS3在此過(guò)程中的表達(dá)變化。方法將大鼠分為對(duì)照組、模型組(卵清蛋白致敏法構(gòu)建大鼠急性哮喘模型)和藥物干預(yù)A組及B組(建模成功后，分別接受60和120 mg/kg的苦參堿治療)。計(jì)算支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸粒細(xì)胞(EOS)絕對(duì)值、EOS百分比及肺組織中的杯狀細(xì)胞百分比和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)積分。酶聯(lián)免疫法分析BALF中的IFN-γ和IL- 4水平，并計(jì)算IFN-γ/IL- 4。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分析肺組織中細(xì)胞因子傳導(dǎo)抑制因子3(SOCS3) mRNA與蛋白的表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠BALF中EOS計(jì)數(shù)、EOS百分比、杯狀細(xì)胞百分比、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分和IL- 4水平，肺組織中的SOCS3 mRNA及蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)。而B(niǎo)ALF中IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)。低劑量和高劑量苦參堿分別顯著緩解模型組的上述變化(P<0.05)。結(jié)論苦參堿可以抑制支氣管哮喘大鼠炎性反應(yīng)、糾正Th1/Th2的失衡，該過(guò)程中存在SOCS3的表達(dá)變化。苦參堿可能通過(guò)降低SOCS3表達(dá)調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡。

支氣管哮喘；苦參堿；IL- 4；IFN-γ；SOCS3；大鼠

支氣管哮喘的發(fā)病過(guò)程涉及嗜酸細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞以及與上述細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子[1]。其中，T輔助細(xì)胞(Th)亞群的比例失衡可能是支氣管哮喘發(fā)生的機(jī)制之一，Th1/Th2的平衡失調(diào)，Th2細(xì)胞過(guò)度活化導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子大量分泌，從而激發(fā)或維持氣道炎性反應(yīng)[2]。因此，大量治療支氣管哮喘藥物都立足于調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫平衡。苦參堿是中草藥苦參(豆科植物)的活性成分，既往研究證實(shí)苦參堿具有抗纖維化、抗感染和抗血管重構(gòu)等多種藥理作用[3]，但其究竟能否在支氣管哮喘中發(fā)揮抗炎作用在研究中。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)與哮喘的關(guān)系較為密切，如有研究表明SOCS3與氣道的高反應(yīng)性有關(guān)[4]。因此，本研究建立了大鼠急性支氣管哮喘模型，驗(yàn)證苦參堿治療能否降低氣道炎性反應(yīng)，以及其機(jī)制是否為調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，同時(shí)驗(yàn)證SOCS3在此過(guò)程中的表達(dá)變化，旨在闡明苦參堿治療哮喘的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： SPF級(jí)雄性SD大鼠，4～6周齡，體質(zhì)量170～200 g(蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：甘醫(yī)動(dòng)字14- 003)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理符合人道主義精神，并且嚴(yán)格填寫(xiě)《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查表》。

1.1.2 主要試劑：苦參堿(寧夏紫金花藥業(yè)股份有限公司)，卵清白蛋白和氫氧化鋁粉末(Sigma公司)。大鼠IL- 4酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑(R&D公司)。RIPA裂解液和BCA蛋白定量分析盒(北京普利萊生物技術(shù)公司)。兔抗大鼠SOCS3多克隆抗體和兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(Abcam公司)，RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)，ImProm-Ⅱ?反轉(zhuǎn)錄試劑盒和GO Taq? qPCR Master Mix[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]，Dy-Light 800 紅外二抗(KPL公司)。

1.2 方法1.2.1 大鼠分組和處理：SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、藥物干預(yù)A組和B組，各組30只。模型組采用卵清蛋白(OVA)致敏法復(fù)制大鼠鼠哮喘模型。藥物干預(yù)A組和B組的哮喘大鼠采用60和120 mg/kg的苦參堿治療灌胃，每日1次，建模成功后開(kāi)始給藥，持續(xù)30 d。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液及肺組織的炎癥細(xì)胞分析：各組處理完畢后，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchocalveolar lavage fluid，BALF)和肺組織，計(jì)算EOS計(jì)數(shù)絕對(duì)值、EOS百分比、氣道杯狀細(xì)胞百分比并評(píng)估氣道周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)記分。

1.2.3 BALF中IFN-γ與IL- 4的測(cè)定：嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒中的說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備樣品。酶標(biāo)儀測(cè)定各組樣品中的IFN-γ與IL- 4含量(ng/L)，并計(jì)算IFN-γ/IL- 4比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 肺組織中SOCS3 mRNA表達(dá)的分析：RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA。用ImProm-Ⅱ?反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取出的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系參照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)。使用GO Taq? qPCR Master Mix試劑盒對(duì)上述合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SOCS3的上游引物為：5′-AC ACTGAGCGTCGAGACCCAGT-3′,下游引物為：5′-A TGTAGTGGTGCACCAACTT-3′；β-actin的上游引物為：5′-TACAACTCCTTGCAGCTCC-3′, 下游引物為：5′-ATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3′。反應(yīng)體系和方案參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用2-△△CT法分析各樣本的SOCS3的相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠炎性細(xì)胞指標(biāo)的比較

模型組大鼠出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)，BALF中EOS計(jì)數(shù)絕對(duì)值、EOS百分比為杯狀細(xì)胞百分比和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。藥物干預(yù)A組與B組大鼠的上述指標(biāo)相對(duì)于模型組有所回降(P<0.05)，但與對(duì)照相比，仍然較高(P<0.05)。同時(shí)，藥物干預(yù)B組大鼠的上述指標(biāo)均低于藥物干預(yù)A組(P<0.05)(表1)。

2.2 各組大鼠的IFN-γ、IL- 4水平及其比值

如圖1所示，模型組大鼠BAFL中的IFN-γ、IFN-γ/IL- 4比值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而IL- 4水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。藥物干預(yù)A組與B組大鼠的上述指標(biāo)相對(duì)于模型組有所緩解(P<0.05)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with model group；△P<0.05 compared with treatment group A圖1 各組大鼠BAFL中的的IL- 4、IFN-γ水平Fig 1 IL- 4 and IFN-γ level in BAFL of each group A

2.3各組大鼠肺組織中SOCS3的mRNA水平表達(dá)變化

模型組大鼠肺組織SOCS3的mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。藥物干預(yù)A組和B組大鼠肺組織的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但顯著低于模型組(P<0.05)(表2)。

2.4各組大鼠肺組織中SOCS3的蛋白水平表達(dá)變化

模型組大鼠的SOCS3蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，藥物干預(yù)A組和B組的SOCS3蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，但顯著低于模型組(P<0.05)(表2，圖2)。

表1 各組大鼠BALF中的EOS計(jì)數(shù)、EOS百分比、肺組織杯狀細(xì)胞百分比及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分Table 1 EOS count, EOS percentage, goblet cells percentage and inflammatory cell infiltration scored in each group

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with model group；△P<0.05 compared with treatment group A.

表2 各組大鼠肺組織中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with model group；△P<0.05 compared with treatment group A.

圖2 各組大鼠肺組織中SOCS的蛋白條帶Fig 2 SOCS protein bands in each group

3 討論

輔助性T淋巴細(xì)胞在整個(gè)免疫系統(tǒng)中處于核心位置，可分為T(mén)h1和Th2兩個(gè)亞群，前者主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，分泌IFN-γ、和IL- 2等；后者介導(dǎo)體液免疫，分泌IL- 4，產(chǎn)生IgE。正常情況下，Th1與Th2兩個(gè)亞群相互作用，相互拮抗處于平衡狀態(tài)[5]。Thl/Th2平衡失調(diào)時(shí)，Th2過(guò)度活化會(huì)產(chǎn)生激發(fā)和維持炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子。因此Thl/Th2平衡與哮喘的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。大鼠IFN-γ/IL- 4比值減小， 意味著Thl/Th2發(fā)生失衡，并且向Th2偏移，提示存在炎性反應(yīng)亢進(jìn)[6]。本研究確實(shí)發(fā)現(xiàn)哮喘大鼠存在Thl/Th2免疫失衡，苦參堿處理后，BALF和氣道周?chē)腅OS等炎性細(xì)胞減少，且大鼠BALF中的IFN-γ/IL- 4有所恢復(fù)，該結(jié)果提示苦參堿可能通過(guò)糾正Thl/Th2失衡來(lái)降低氣道炎性反應(yīng)。

為了進(jìn)一步了解苦參堿對(duì)Thl/Th2平衡調(diào)控的機(jī)制，本研究檢測(cè)了各組大鼠SOCS3的表達(dá)水平。SOCS3有信號(hào)傳導(dǎo)抑制功能，參與酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)傳導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活通路，即JAK-STAT通路的負(fù)向調(diào)節(jié)。SOCS3可以通過(guò)該途徑控制細(xì)胞因子傳導(dǎo)，與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、凋亡等多種細(xì)胞現(xiàn)象發(fā)生關(guān)聯(lián)。既往研究證實(shí)，哮喘患者的血清SOCS3 mRNA水平顯著增高，且與血清中IgE水平及病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這證實(shí)SOCS3與哮喘過(guò)程中的Thl/Th2失衡、哮喘氣道高反應(yīng)性有關(guān)[7]。其機(jī)制為SOCS3可與IL- 12受體β鏈的胞漿段結(jié)合，抑制IL- 12介導(dǎo)的STAT4轉(zhuǎn)錄活化，于是Thl分化被抑制，Th2的分化得到加強(qiáng)，出現(xiàn)Thl/Th2失衡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠的SOCS3表達(dá)明顯增高，而苦參堿處理后SOCS3表達(dá)相對(duì)減少，說(shuō)明SOCS3的表達(dá)可能與大鼠血清中的IFN-γ/IL- 4變化有一定的關(guān)系，這與既往研究是一致的。但是本研究未闡明苦參堿如何降低SOCS3的水平，SOCS的其他家族成員與苦參堿調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡的機(jī)制有無(wú)關(guān)系也尚不清楚，這些有待于在后期的研究中進(jìn)行。總之，苦參堿可以通過(guò)調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡來(lái)減少哮喘大鼠的炎性反應(yīng)，該機(jī)制可能與苦參堿能降低SOCS3的表達(dá)有關(guān)。

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新聞點(diǎn)擊

酒精成癮易導(dǎo)致飲食失調(diào)

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年8月22日?qǐng)?bào)道，最新醫(yī)學(xué)研究指出，酒精成癮患者較容易出現(xiàn)飲食失調(diào)問(wèn)題，其中最明顯的就是神經(jīng)性暴食癥(bulimia nervosa)，可能是基因?qū)е隆?/p>

2013年9月《酒精與藥物研究期刊》(Journal of Studies on Alcohol and Drugs)刊登研究報(bào)告指出，酒精成癮癥的患者，比較容易出現(xiàn)飲食失調(diào)問(wèn)題，同樣的，飲食失調(diào)患者，也較容易酒精成癮，這可能與基因有關(guān)。

參與這項(xiàng)研究的圣路易斯華盛頓大學(xué)(Washington University in St. Louis)研究人員莫恩契爾諾夫(Melissa Munn-Chernoff)認(rèn)為，先前醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，飲食失調(diào)患者有著較高比例的酗酒與酒精成癮問(wèn)題，也有研究發(fā)現(xiàn)酒精成癮患者出現(xiàn)暴食癥的概率，超過(guò)出現(xiàn)厭食癥的概率，但兩者之間的關(guān)系能否從基因角度解釋?zhuān)侥壳盀橹箾](méi)有進(jìn)一步探究。

莫恩契爾諾夫與研究團(tuán)隊(duì)以6 000名澳大利亞雙胞胎為研究對(duì)象，通過(guò)一系列診斷，分析日常喝酒與飲食習(xí)慣。

研究人員比較雙胞胎之間數(shù)據(jù)資料發(fā)現(xiàn)，某個(gè)人是否會(huì)出現(xiàn)酗酒、暴食癥或厭食癥，與基因有很大的關(guān)聯(lián)，例如在雙胞胎女性身上，可通過(guò)基因判定發(fā)生前述3種失調(diào)癥的概率，風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)為38%～53%。

血糖太高易致癌

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年8月22日?qǐng)?bào)道，根據(jù)馬德里胡安卡洛斯國(guó)王大學(xué)(Universidad Rey Juan Carlos)研究人員發(fā)表在《分子細(xì)胞》(Molecular Cell)期刊的一項(xiàng)研究，血液中高濃度的糖將引起生化級(jí)聯(lián)(biochemical cascade)，從而直接導(dǎo)致癌癥。這一研究可能有助于解釋長(zhǎng)期以來(lái)已知的不良飲食習(xí)慣與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加之間的關(guān)聯(lián)。

盡管糖對(duì)很多身體功能是必需的，但健康人的血糖水平靠激素胰高血糖素和胰島素調(diào)節(jié)，保持在一個(gè)相對(duì)狹窄的范圍內(nèi)。當(dāng)一個(gè)人血糖稍微偏高時(shí)將被診斷為糖尿病前期，當(dāng)血糖升至更高時(shí)將被認(rèn)為是糖尿病。

無(wú)論糖尿病還是糖尿病前期都明顯多見(jiàn)于體質(zhì)量超重和肥胖的人。事實(shí)上2型糖尿病實(shí)際是由許多與肥胖相關(guān)聯(lián)的因素引起的。研究人員認(rèn)為，糖尿病和肥胖人群有著更高的患癌風(fēng)險(xiǎn)，但引起這種情況的原因仍不清楚。

新的研究結(jié)果來(lái)自于一項(xiàng)探討腸細(xì)胞如何通過(guò)釋放GIP(一種標(biāo)志胰腺釋放胰島素的激素)來(lái)對(duì)糖產(chǎn)生反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。研究人員發(fā)現(xiàn)，一種名為s-catenin的蛋白質(zhì)在腸細(xì)胞釋放GIP的能力中起到了關(guān)鍵作用，而如果血液中存在太多糖分，這種蛋白質(zhì)將更為活躍。

值得注意的是，之前的研究已經(jīng)表明，s-catenin也能干擾細(xì)胞的自然生命周期，使它們成為癌前細(xì)胞。研究人員所做的進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)了如存在高血糖，細(xì)胞將在其細(xì)胞核中積累s-catenin，直接導(dǎo)致與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞增殖。

Matrine suppresses inflammation and corrects Th1/Th2 imbalance in asthmatic rats via down-regulating SOCS3

FAN Lin-xia, PAN Hui, LIU Hua*, CAI Xi-guang, CHEN Qi-zhang, YAN Li-pin, WANG Xiao-jun

(Dept. of Respiration, Gansu Provincial Hospital, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of matrine on inflammation by regulating Th1/Th2 balance in asthmatic rats and the underlying mechanism related to SOCS3.MethodsOvalbumin-sensitized rats were established as asthma model, Animals randomly divided into four groups, as follows: control (without any treatment), model group, treatment group A (low-dose matrine treated asthma rats) and treatment group B (high-dose matrine treated asthma rats). The eosinophil counting, goblet cells percentage, inflammatory cell infiltration in rat lung were analyzed and scored by morphological examination. IL- 4 and IFN-γ level in BALF were determined by ELISA and IFN-γ/IL- 4 ratio was further calculated. Furthermore, the expression of SOCS3 in mRNA and protein level were detected by qRT-PCR and Western blot, respectively.ResultsEosinophil count and percentage, goblet cell percentage and inflammatory cell infiltration score were significantly lower than that in

asthma; matrine; IL- 4; IFN-γ; SOCS3; rats

2014- 05- 30

：2014- 09- 28

甘肅省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥項(xiàng)目(GZK- 2011- 67)

*通信作者(correspondingauthor)：liuhua_lanzhou@163.com

1001-6325(2015)02-0191-05

研究論文

R 562.2

：A

treatment group A and B as compare to model group (P<0.05). The group A exhibited a lower IFN-γ level and a higher IL- 4 level (P<0.05). IFN-γ level in treatment group A and B were higher while IL- 4 level were lower as compare to model group. Meanwhile, SOCS3 mRNA level in rat lung tissue was elevated in model group. Matrine treatment decreased SOCS3 expression in group A and B. Similar trend was found in SOCS3 protein level.ConclusionsMatrine may exhibit antiinflammatory effect by inhibiting SOCS3 expression and correcting Th1/Th2 balance in asthmatic rats.