載有槲皮素的PEG-PE膠束對(duì)乳腺癌細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)

吳金花，段金虹，許海燕，楊先達(dá)*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 1.病理學(xué)與病理生理學(xué)系； 2.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，北京 100005)

?

載有槲皮素的PEG-PE膠束對(duì)乳腺癌細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)

吳金花1，段金虹1，許海燕2，楊先達(dá)1*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 1.病理學(xué)與病理生理學(xué)系； 2.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，北京 100005)

目的探索載有槲皮素的PEG-PE聚合物膠束(M-Q)能否在體外逆轉(zhuǎn)耐阿霉素人乳腺癌細(xì)胞(MCF- 7 ADRr)的耐藥性。方法將PEG-PE聚合物與槲皮素混合制備脂膜，加0.9%氯化鈉注射液形成膠束，用動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀表征其尺寸分布，并將其和阿霉素與MCF- 7 ADRr細(xì)胞共孵育72 h，用MTS方法檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率。結(jié)果PEG-PE聚合物膠束能有效運(yùn)載槲皮素，其包封率高達(dá)74%以上，平均粒徑為11.11 nm左右，與游離槲皮素相比，M-Q能在體外更大程度地逆轉(zhuǎn)MCF- 7 ADRr細(xì)胞對(duì)于阿霉素的耐藥性(P<0.05)，且PEG-PE膠束自身對(duì)靶細(xì)胞無明顯殺傷作用。結(jié)論載有槲皮素的PEG-PE膠束在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性方面具有應(yīng)用潛能。

PEG-PE；膠束；槲皮素； MCF- 7 ADRr細(xì)胞

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的常見腫瘤,雖然近年來在其診斷及治療方面有長(zhǎng)足的進(jìn)步，但乳腺癌患者的病死率仍然居高不下[1- 2]，主要原因之一是腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生多藥耐藥性[3]，減弱化療效果，導(dǎo)致化療的失敗。

槲皮素(Quercetin, Q)是一種天然的黃酮類化合物，有助于逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。其機(jī)制可能是通過抑制P-糖蛋白的表達(dá)及活性，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的排放，從而使較多的藥物留在胞內(nèi)，增強(qiáng)其抗腫瘤作用[4]。然而，由于槲皮素水溶性差，限制了其臨床應(yīng)用，因而迫切需要開發(fā)能在水溶液中穩(wěn)定存在的高效載藥系統(tǒng)來運(yùn)載槲皮素。

聚合物膠束是近年來出現(xiàn)的一種新型納米藥物載體,同時(shí)具有親水性外殼和疏水性內(nèi)核，具有多種優(yōu)良的性能,如在體內(nèi)外環(huán)境中較高的穩(wěn)定性、對(duì)難溶性藥物的增溶作用等[5]。聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)是經(jīng)美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的可用于人體的藥物載體材料，具有良好的生物相容性和安全性。由于其臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)很低(1×10-6～1×10-5mol/L)，因而形成的膠束穩(wěn)定，粒徑較小(<50 nm)，并具有長(zhǎng)循環(huán)特性[6]。本研究利用PEG-PE膠束可攜帶難溶性藥物的特性，制備出載有槲皮素的PEG-PE膠束(quercetin-loaded PEG-PE Micelles，M-Q)，并在體外初步評(píng)估了其對(duì)MCF- 7 ADRr細(xì)胞耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

mPEG2000-PE(Avanti polar lipids)，阿霉素(上海譜振生物科技有限公司)，人乳腺癌細(xì)胞(MCF- 7)和阿霉素耐藥性人乳腺癌細(xì)胞(MCF- 7 ADRr)(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(HyClone公司)，MTS試劑(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：MCF- 7和MCF- 7 ADRr均按細(xì)胞數(shù)5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 M-Q的制備：將mPEG2000-PE和槲皮素分別溶解于三氯甲烷和無水乙醇中，以不同的濃度比混合此兩種有機(jī)溶液，然后將混合溶液置于氮?dú)猸h(huán)境下蒸發(fā)至形成一層均勻干燥薄膜，靜置2 h之后，加入0.9%氯化鈉注射液使薄膜水合。50 ℃水浴下水化30 min后，常溫靜置2 h，制備出M-Q。

1.2.3 M-Q的粒徑、包封率及載藥率的測(cè)定：用Zeta Sizer 3000動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀測(cè)定其粒徑。本實(shí)驗(yàn)采用超速離心法分離游離藥物后以紫外分光光度法測(cè)定其包封率和載藥率。將一定體積的M-Q加入離心超濾管，測(cè)定經(jīng)高速離心(13 000 r/min,10 min)后沉淀中的槲皮素質(zhì)量。包封率、載藥率的測(cè)定根據(jù)以下公式:

式中W總為總藥量(mg)，W游為高速離心后沉淀的藥量(mg)，W膠束為PEG-PE膠束的總質(zhì)量(mg)。

1.2.4 M-Q對(duì)于MCF- 7 ADRr細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)：將MCF- 7 ADRr接種于96孔板，分別加入游離槲皮素(Q)、M-Q、阿霉素(ADR)、ADR+Q和ADR+M-Q，其中Q的濃度均為5 μmol/L。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中共孵育72 h后，PBS洗滌2次，每孔加入20 μLMTS試劑，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育0.5 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度值。

1.2.5 PEG-PE膠束自身對(duì)靶細(xì)胞的影響：將不同濃度(15、30、60和120 μmol/L)的PEG-PE膠束，分別與一定量的MCF- 7 ADRr細(xì)胞共孵育72 h后，用MTS試劑檢測(cè)腫瘤細(xì)胞存活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 M-Q的粒徑測(cè)定

空膠束與載藥膠束的粒徑相似，無明顯差異，均為11 nm左右(圖1)。

圖1 動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀對(duì)空膠束和載藥膠束的尺度評(píng)估Fig 1 Size distributions of blank micelles(M) and quercetin-loaded micelles(M-Q)evaluated by DLS

2.2 M-Q的載藥率和包封率

當(dāng)載藥率小于3%時(shí)，包封率大于87.7%；當(dāng)載藥率達(dá)到4%時(shí)，包封率顯著下降至74%。不同載藥率下的膠束粒徑相似，均為10 nm左右(表1)。

2.3M-Q對(duì)于MCF-7ADRr細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)

不同濃度的阿霉素對(duì)兩種細(xì)胞的殺傷具有顯著差異。當(dāng)阿霉素濃度≤0.025 μmol/L時(shí)，阿霉素對(duì)兩種細(xì)胞的殺傷作用均不明顯；當(dāng)阿霉素濃度≥0.05 μmol/L時(shí)，MCF- 7 ADRr的存活率顯著高于聯(lián)合用藥結(jié)果顯示，阿霉素聯(lián)合M-Q組對(duì)MCF- 7 ADRr細(xì)胞殺傷率最高，顯著高于阿霉素組及阿霉素聯(lián)合游離槲皮素組(P<0.05)(圖3)。

表1 M-Q的載藥率、包封率和粒徑

MCF- 7(P<0.05)(圖2)，MCF- 7 ADRr的耐藥性有顯著體現(xiàn),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的阿霉素濃度為0.05 μmol/L。

*P<0.05 compared with MCF- 7 group圖2 不同濃度阿霉素(ADR)對(duì)MCF- 7和MCF- 7 ADRr的殺傷作用Fig 2 Anti-tumor cytotoxicity generated by adriamycin (ADR) of various concentrations

*P<0.05 compared with ADR+M-Q group圖3 M-Q對(duì)于MCF- 7 ADRr細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)Fig 3 Potency of the adriamycin (ADR)-sensitizing activity of M-Q in MCF- 7 ADRr cells

2.4 PEG-PE膠束自身對(duì)靶細(xì)胞的影響

PEG-PE膠束的細(xì)胞毒性評(píng)估顯示，15、30、60和120 μmol/L的PEG-PE膠束均對(duì)MCF- 7 ADRr細(xì)胞的存活沒有顯著影響，與對(duì)照組相比無明顯差異(圖4)。

圖4 不同濃度的PEG-PE膠束與MCF- 7 ADRr細(xì)胞共孵育72 h后的細(xì)胞存活率Fig 4 Viability of MCF- 7 ADRr cells 72 hours after co-incubation with PEG-PE micelles of various concentrations

3 討論

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性是阻礙腫瘤治療進(jìn)步的一個(gè)重要因素[3]，所以槲皮素逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性這一性質(zhì)具有較為重要的醫(yī)學(xué)意義。但由于槲皮素水溶性差，限制了其作為一種藥物的應(yīng)用潛能。納米科技為解決這一問題提供了全新的技術(shù)手段。既往研究顯示，PEG-PE聚合物膠束粒徑小，具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，并且對(duì)于難溶性藥物有增溶作用[5]，可作為運(yùn)載槲皮素的載體。然而，目前尚無運(yùn)用PEG-PE膠束運(yùn)載槲皮素逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的報(bào)道，因此有必要研究M-Q是否能有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

本研究所采用的聚合物膠束是以PEG-PE為原料而制成的，具有良好的生物相容性和安全性，同時(shí)具有親水性外殼和疏水性內(nèi)核，且粒徑較小，約10 nm，有利于進(jìn)入腫瘤組織。耐藥性實(shí)驗(yàn)顯示，M-Q能在體外有效逆轉(zhuǎn)MCF- 7 ADRr細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，且其逆轉(zhuǎn)作用優(yōu)于游離槲皮素，推測(cè)這一現(xiàn)象可能是因?yàn)檩d藥膠束更容易被腫瘤細(xì)胞攝取，從而增強(qiáng)了槲皮素的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。此外，本研究觀察到PEG-PE膠束自身對(duì)MCF- 7 ADRr細(xì)胞沒有顯著的殺傷作用，提示PEG-PE聚合物膠束是一種安全而有效的載藥系統(tǒng)。

綜上所述，本研究利用PEG-PE膠束運(yùn)載槲皮素，構(gòu)建了載有槲皮素的PEG-PE膠束，發(fā)現(xiàn)該載藥膠束能在體外有效逆轉(zhuǎn)MCF- 7 ADRr細(xì)胞對(duì)于阿霉素的耐藥性，且其逆轉(zhuǎn)作用顯著優(yōu)于游離槲皮素。該結(jié)果提示，載有槲皮素的PEG-PE膠束在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

[1] Peternel L, Kristan K, Petrusevska M,etal. Suitability of isolated rat jejunum model for demonstration of complete absorption in humans for bcs-based biowaiverrequest[J]. Pharm Sci,2012, 101: 1436- 1449.

[2] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013[J].CA Cancer J Clin, 2013, 63: 11- 30.

[3] Zhang F, Zhang H, Wang Z,etal. P-glycoprotein associates with anxa2 and promotes invasion in multidrug resistant breast cancer cells[J]. Biochem Pharmacol, 2014, 87:292- 302.

[4] Scambia G, Ranelletti FO, Panici PB,etal. Quercetin potentiates the effect of Adriamycin in a multidrug-resistant MCF- 7 human breast-cancer cell line: P-glycoprotein as a possible target[J]. Cancer Chemother Pharmacol,1994, 34:459- 464.

[5] Park EK, Lee SB, Lee YM. Preparation and characterization of methoxypoly(ethylene glycol)/poly(ε-caprolactone) amphiphilic block copolymericnanospheres for tumor-specific folate-mediated targeting of anticancer drugs[J]. Biomaterials, 2005, 26: 1053- 1061.

[6] Lukyanov AN, Gao ZG, Mazzola L,etal. Polyethylene glycol-diacyllipid micelles demonstrate increased accumulation in subcutaneous tumors in mice[J]. Pharm Res, 2002, 19: 1424- 1428.

Quercetin-loaded PEG-PE micelles reverse drug resistance of MCF- 7 ADRr human breast cancer cells

WU Jin-hua1, DUAN Jin-hong1, XU Hai-yan2, YANG Xian-da1*

(1.Dept. of Pathology and Pathophysiology; 2.Dept. of Biomedical Engineering, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005,China)

ObjectiveTo explore whether quercetin- loaded PEG-PE micelles(M-Q) can synergize the growth- inhibitory activity of adriamycin prepared (ADR)by reversing the drug resistance of MCF- 7 ADRr breast cancer cellsinvitro.MethodsM-Q was prepared by adding saline to lipid film containing quercetin and PEG-PE. The size of M-Q was characterized by dynamic light scattering(DLS). The inhibition of MCF- 7 ADRr cells was evaluated by MTS assay after incubation with M-Q and ADR.ResultsThe incorporation efficiency of quercetin by the micelles was above 74%.The average size of M-Q was 11.11 nm. Compared with the quercetin dissolved in ethanol, M-Q more effectively reversed the drug resistance of MCF- 7 ADRr cellsinvitro.ConclusionsPEG-PE micelles may potentially deliver quercetin to cancer cells for reversal of drug resistance.

PEG-PE; micelles; quercetin; MCF- 7 ADRr cells

2014- 07- 11

：2014- 10- 27

科技部重大科學(xué)計(jì)劃(2011CB933504)

*通信作者(correspondingauthor)：ayangmd@gmail.com

1001-6325(2015)02-0174-04

研究論文

R 34

：A