CIP2A shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

師海蓉

(江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室, 湖北 武漢 430056)

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CIP2A shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

師海蓉*

(江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室, 湖北 武漢 430056)

目的構(gòu)建靶向CIP2A的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒并探討其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用。方法根據(jù)siRNA原理設(shè)計(jì)4對(duì)靶向CIP2A的siRNA序列，克隆到真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo中(shRNA- 1、2、3和4)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系BGC- 823，real-time PCR 和Western blot法檢測(cè)并篩選最佳抑制效率的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，CCK- 8法檢測(cè)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果4個(gè)靶向CIP2A的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切和測(cè)序證實(shí)基因已正確插入，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到70%以上。轉(zhuǎn)染后24、48 和72 h，4個(gè)質(zhì)粒均明顯降低BGC- 823細(xì)胞內(nèi)CIP2A mRNA 和蛋白的表達(dá)。相較于其他3個(gè)重組質(zhì)粒，shRNA- 1的抑制作用更為顯著，且對(duì)胃癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用 (P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建的靶向CIP2A的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，可有效抑制胃癌細(xì)胞CIP2A的mRNA和蛋白表達(dá)，并抑制胃癌細(xì)胞的增殖，為今后研究CIP2A在胃癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

CIP2A; 短發(fā)卡RNA; 胃癌; 蛋白磷酸酶2A

蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A, CIP2A)又名KIAA1524、P90腫瘤相關(guān)抗原[1- 3]，2000年首次在小片段胎腦cDNA文庫(kù)中被克隆出來(lái)[2]，基因定位于染色體3q13.13。定量RT-PCR方法檢測(cè)21種人良性組織樣本CIP2A mRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，除在骨髓、腦、小腦和前列腺等組織中呈中到高度表達(dá)外，在被檢測(cè)的其余組織中表達(dá)均較低[3]。而在惡性腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，CIP2A在包括胃癌[3- 5]在內(nèi)的多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生具有良好的相關(guān)性。CIP2A有助于預(yù)測(cè)胃癌患者生存時(shí)間，對(duì)于腫瘤大小在5 cm以?xún)?nèi)的胃腺癌患者，其腫瘤標(biāo)本的CIP2A的表達(dá)與總生存率相關(guān)，CIP2A(+)和CIP2A(-)的患者10年生存率分別為8.1%和37.6%[6]。然而，目前對(duì)于CIP2A基因和蛋白表達(dá)、功能調(diào)控的機(jī)制研究尚不豐富。為進(jìn)一步闡明CIP2A基因和蛋白表達(dá)在胃癌中的機(jī)制，擬通過(guò)構(gòu)建靶向CIP2A的短發(fā)卡RNA(shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，為深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌BGC- 823細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)中所用的各種工具酶、核酸標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker以及蛋白預(yù)染Marker(MBI Fermentas公司)。 去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)?？贵wCIP2A(Santa Cruz公司)，抗體β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)。引物的合成及DNA序列測(cè)定(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。CCK- 8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶向CIP2A的shRNA設(shè)計(jì)：根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，選擇CIP2A cDNA序列上的4個(gè)部位作為目標(biāo)序列，同時(shí)將選中的shRNA中的堿基序列隨機(jī)打亂設(shè)計(jì)為陰性對(duì)照(shRNA. NC)，對(duì)照序列經(jīng)BLAST檢測(cè)證實(shí)與CIP2AmRNA及其他基因編碼序列無(wú)同源性。shRNA模板中的Loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào)，轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5′端添加CACC，與BbsⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ)；反義鏈模板的5′端添加GATC，與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ)；如果siRNA的第1個(gè)堿基不是G, 則在CACC后補(bǔ)加一個(gè)G(表1)。

1.2.2 靶向CIP2A shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定: 按照如下配比配置退火反應(yīng)體系: 10×shDNA 退火緩沖液 5 μL，正義鏈 (100 μmol/L)5 μL，反義鏈(100 μmol/L) 5 μL， ddH2O 35 μL。退火處理：95 ℃ 5 min，85 ℃ 5 min，75 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。用T4 DNA連接酶將準(zhǔn)備好的插入片段連接到純化質(zhì)粒載體pGPU6的BbsⅠ與BamHⅠ之間，22 ℃ 1 h，轉(zhuǎn)化到Top 10感受態(tài)細(xì)胞。挑取菌落， 接種到含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h。堿裂解法抽提質(zhì)粒，酶切(陽(yáng)性重組載體應(yīng)該可以被BamHⅠ切開(kāi)，而不能被PstⅠ切開(kāi))并測(cè)序鑒定。

表1 CIP2A shRNA和shRNA. NC序列Table 1 Sequences of CIP2A shRNA and shRNA.NC

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率測(cè)定：按Lipofectamin 2000使用說(shuō)明在細(xì)胞對(duì)數(shù)增殖期進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA.NC質(zhì)粒為對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后置于熒光顯微鏡下觀察。轉(zhuǎn)染效率 = (發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/可見(jiàn)光下的總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)CIP2A mRNA的表達(dá)：分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h收集細(xì)胞，以Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量RNA, 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性。以基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin 作為內(nèi)參。CIP2A引物(上游：5′-GATAGACTGATTGCTCAGCATCGC-3′，下游：5′-ACATACTAGCAAGTGTCCGTGCCTC-3′， 73 bp)。β-actin 引物(上游：5′-CCCTGGCACCCAGC AC-3′，下游：5′-GCCGATCCACACGGAGTAC-3′，70 bp)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。組間的表達(dá)差異通過(guò)計(jì)算2-ΔΔCt予以表示。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)CIP2A蛋白表達(dá)的影響:分別于轉(zhuǎn)染24、48和72 h后提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，加注抗體，ECL顯影。應(yīng)用Gel-Pro Analyzer軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 CCK- 8檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的胃癌細(xì)胞，按5×103/孔的細(xì)胞濃度接種于96孔板，每組5重復(fù)。分別于轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h，傾去培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)基100 μL，每孔避光加入CCK- 8 10 μL，避光培養(yǎng)2 h，檢測(cè)450 nm 的吸光度(A450)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

酶切結(jié)果表明，重組載體被BamHⅠ切開(kāi)，而不能被PstⅠ切開(kāi)。將陽(yáng)性克隆測(cè)序證實(shí)設(shè)計(jì)序列正確插入載體且無(wú)突變，表明4個(gè)質(zhì)粒均為陽(yáng)性重組載體。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h的效率為70%以上(圖1)。

A.normal; B.fluorescence圖1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BGC- 823細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)Fig 1 The expression of green fluorescent protein(GFP) in BGC- 823 cells transfected with recombinant plasmids (×100)

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)CIP2A mRNA表達(dá)的影響

4個(gè)重組質(zhì)粒對(duì)BGC- 823細(xì)胞CIP2AmRNA表達(dá)在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有顯著的抑制效果(圖2)。

*P<0.01 compared with shRNA-NC圖2 RT-PCR檢測(cè)CIP2A基因的表達(dá)Fig 2 CIP2A mRNA detected by RT-PCR

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)CIP2A蛋白表達(dá)的影響

4個(gè)重組質(zhì)粒對(duì)BGC- 823細(xì)胞CIP2A蛋白表達(dá)都有抑制效果, 以CIP2A shRNA- 1最為顯著(圖3)。

2.5 重組質(zhì)粒對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯受到抑制(P<0.01)(圖4)。

A.Western blot； B.quantitative analysis; *P<0.05, **P<0.01 compared with shRNA-NC圖3 Western blot檢測(cè)I2PP2A蛋白的表達(dá)Fig 3 I2PP2A protein detected by Western blot

*P<0.01 compared with shRNA-NC圖4 CCK- 8法檢測(cè)siRNA對(duì)BGC- 823細(xì)胞增殖抑制作用Fig 4 Transfected siRNA on the proliferation of BGC- 823 cells tested by CCK- 8 assay

3 討論

作為潛在的腫瘤抑制因子，蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)活性的抑制被認(rèn)為是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的前提條件。因此，探尋抑制PP2A活性的分子靶標(biāo)極具防治腫瘤意義。以往對(duì)PP2A活性的研究都是利用外源性的病毒抗原或化學(xué)抑制因子證實(shí)PP2A具有抑癌作用，對(duì)內(nèi)源性特異性抑制因子如SET和CIP2A研究較少。

CIP2A 在人胃癌中過(guò)度表達(dá), 并與臨床病理參數(shù)和預(yù)后有一定關(guān)系[7]。CIP2A可直接結(jié)合于癌轉(zhuǎn)錄因子c-Myc，抑制PP2A對(duì)其絲氨酸62位(S62)的去磷酸化作用, 從而抑制c-Myc蛋白水解并促進(jìn)c-Myc蛋白的穩(wěn)定性[3]。對(duì)多種腫瘤的研究表明CIP2A的促癌作用與p-Akt密切相關(guān)[8- 12]。胃癌細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)CIP2A的表達(dá)缺失顯著抑制胃癌細(xì)胞系集落形成的能力[4, 6]。

以上研究提示，CIP2A在維持細(xì)胞表形轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)方面可能起關(guān)鍵作用。因此下調(diào)在胃癌中過(guò)表達(dá)的CIP2A可作為一個(gè)潛在的腫瘤治療的靶點(diǎn)。然而其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制及臨床相關(guān)性仍不清楚。該蛋白能否成為診斷腫瘤的標(biāo)志物以及癌癥治療的靶點(diǎn)仍需要進(jìn)一步研究。

RNA干擾是基因功能研究的重要方法[13- 14]，因此構(gòu)建靶向CIP2A的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CIP2A，是進(jìn)一步深入研究CIP2A功能的基礎(chǔ)。本研究中構(gòu)建的載體其優(yōu)勢(shì)是選用人U6 RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子，并利用相對(duì)單一的啟動(dòng)子和終止序列從而能夠產(chǎn)生大量的shRNA達(dá)到有效的干擾效果。針對(duì)目的基因構(gòu)建的4個(gè)重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系BGC- 823和SGC- 7901(結(jié)果未顯示)后，采用免疫熒光驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率， RT-PCR和 Western blot法驗(yàn)證重組質(zhì)粒對(duì)靶基因的抑制效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4對(duì)shRNA序列均具有較高的抑制效率，其中shRNA- 1對(duì)靶基因抑制效率最為顯著，并在轉(zhuǎn)染后96 h仍能有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖。因此可選擇抑制效率高的shRNA- 1進(jìn)行后續(xù)研究，為進(jìn)一步研究CIP2A在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及胃癌的分子生物學(xué)治療奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of eukaryotic expression vector of shRNA targeting CIP2A gene and its inhibition effect on BGC-823 cell proliferation

SHI Hai-rong*

(Dept. of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan 430056, China)

ObjectiveTo construct eukaryotic vectors expressing short hairpin RNAs (shRNAs) targeting at the CIP2A gene and to explore its effects on gastric cell line BGC- 823.MethodsFour oligonucleotides targeting the CIP2A gene were synthesized and cloned into the eukaryotic expression plasmid pGPU6. The recombinant plasmids, pGPU6/GFP/Neo-CIP2A-shRNA- 1, 2, 3 and 4, were introduced into BGC- 823 cells by lipofectamine-mediated transfection and the infection rate was observed by fluorescence microscope. The gene silencing efficiency was measured by real-time PCR and Western blot. The effects on proliferation of BGC- 823 cells were detected by CCK- 8.ResultsDNA sequencing and enzyme digestion analysis confirmed the identity of the four recombinant shRNA expression vectors. Immunofluorescsence demonstrated that transfection efficiency was above 70%. Transfection of shRNA- 1, 2, 3 and 4, significantly knocked down the expression of CIP2A mRNA and protein at 24, 48 and 72 h after transfection. Compared with the 2, 3 and 4, shRNA- 1 had the more strong inhibitory effect on the expression of CIP2A mRNA and protein. The CCK- 8 assay showed that the anti-proliferation effect on BGC- 823 cells was significant (P< 0.05).ConclusionsThe recombinant vector may effectively inhibit the expression of

CIP2A; short hairpin RNA; gastric cancer; PP2A

2014- 05- 15

：2014- 07- 17

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001082)

*通信作者(correspondingauthor)：shihairong111@126.com

1001-6325(2015)02-0162-05

研究論文

R 735.2

：A

CIP2A in BGC- 823 cells and depress the proliferation of BGC- 823 cells.