HPLC法測定五維賴氨酸顆粒中維生素B1、維生素B2、維生素B6的含量

孫晶晶，孫佳玲，孫秋.吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林長春　30033；.吉林省白城市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林白城　37000

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HPLC法測定五維賴氨酸顆粒中維生素B1、維生素B2、維生素B6的含量

孫晶晶1，孫佳玲1，孫秋2
1.吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林長春130033；2.吉林省白城市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林白城137000

[摘要]目的建立HPLC法測定五維賴氨酸顆粒中維生素B1、維生素B2、維生素B6含量的方法。方法采用高效液相色譜法；色譜柱為Agela-C18；流動(dòng)相：三乙胺-冰醋酸-甲醇-8mmol/L己烷磺酸鈉溶液（0.2：7.5:220:775）；檢測波長280 nm；流速1.0mL/min。結(jié)果維生素B1、維生素B2、維生素B6分別在0.622 9～7.474 8μg（r=1.000）、0.087 7～1.052 9μg（r= 1.000）、0.041 45～0.497 4μg（r=1.000）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，平均回收率分別為100.2%（RSD:0.3%）、100.9%（RSD: 0.5%）、98.6%（RSD:1.8%）。結(jié)論該方法簡便，準(zhǔn)確，可用于五維賴氨酸顆粒的含量測定。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜；五維賴氨酸顆粒；含量測定

五維賴氨酸顆粒是由鹽酸賴氨酸、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣組成的復(fù)方制劑，用于促進(jìn)小兒、兒童正常發(fā)育及年老體弱者的營養(yǎng)補(bǔ)充。國內(nèi)現(xiàn)有兩家生產(chǎn)企業(yè)，延邊大學(xué)草仙藥業(yè)有限公司僅添加了蔗糖一種輔料，南京厚生藥業(yè)有限公司添加的輔料種類較多，有甘露醇、蔗糖、健康糖、橘子香精和聚乙烯吡咯烷酮等?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)第七冊[1]，僅對鹽酸賴氨酸的含量進(jìn)行測定，未對其他組分進(jìn)行測定。由于五維賴氨酸顆粒主成分含量低且一家企業(yè)的輔料種類復(fù)雜，按照文獻(xiàn)[2]中的含量測定方法各組分無法達(dá)到基線分離，不能用于各組分的含量測定。因此，本試驗(yàn)改進(jìn)建立了高效液相色譜法同時(shí)測定維生素B1、維生素B2、維生素B6的含量，該方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，適用范圍廣，有利于更好地控制藥品質(zhì)量。

1　儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀（AgilentchemStation色譜工作站）；島津UV-1700紫外-可見分光光度計(jì)；THZ-82型恒溫水浴振蕩器。

五維賴氨酸顆粒（批號：110108，120426，120427，120428；批號：111004、120105）；維生素B1對照品批號：100390-200301，維生素B2對照品批號：100369-200301，含量：98.7%，維生素B6對照品批號：100116-200502，均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、冰醋酸、三乙胺為色譜純，水為超純水；其他試劑為分析純。

圖1　五維賴氨酸顆粒HPLC色譜圖

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Agela-C18(5.0μm，4.6mm×250mm)；流動(dòng)相：三乙胺-冰醋酸-甲醇-8mmol/L己烷磺酸鈉溶液（0.2:7.5: 220:775）；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

在上述色譜條件下，供試品色譜圖中有與維生素B1、維生素B2、維生素B6對照品峰保留時(shí)間一致的色譜峰，且與其它相鄰色譜峰的分離良好?？瞻讟悠吩诰S生素B1、維生素B2、維生素B6保留時(shí)間處無色譜峰，不存在干擾，見圖1。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液精密稱取維生素B1、維生素B2、維生素B6對照品適量，加水-乙腈-冰醋酸（94:5:1）混合溶液適量，置70℃水浴中振蕩1 h，冷卻至室溫，并定量稀釋制成每1 mL中含維生素B10.12 mg、維生素B215μg及維生素B67.5μg的混合溶液，即得。

2.2.2供試品溶液 取本品10袋內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取約5 g，置50 mL量瓶中，加水-乙腈-冰醋酸（94:5:1）混合溶液適量，使溶解后，置70℃水浴中振蕩1 h，冷卻至室溫，加上述混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3陰性對照溶液按處方比例并以相同工藝制備不含維生素B1、維生素B2、維生素B6的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.3線性關(guān)系的考察

分別精密吸取對照品溶液5、10、15、20、25、30、35、40、60μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得維生素B1、維生素B2、維生素B6的回歸方程分別為y=7.551 3+1 025.40x，r=1.000；y=6.380 4+3 727.28x，r=1.000；y= 6.064 5+2 060.50x，r=1.000。表明維生素B1、維生素B2、維生素B6進(jìn)樣量分別在0.622 9～7.474 8μg、0.087 7～1.052 9 μg、0.041 45～0.497 4μg范圍內(nèi)，與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

2.4精密度試驗(yàn)

取同一批樣品（延邊草仙藥業(yè)，批號：110108）制備的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20μL，記錄峰面積，結(jié)果維生素B1、維生素B2、維生素B6的峰面積RSD分別為0.1%、0.7%、0.4%。表明儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（延邊草仙藥業(yè)，批號：110108），制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果維生素B1、維生素B2、維生素B6的平均含量分別為1.112 mg/g、0.139mg/g、0.074 5mg/g，RSD分別為0.1%、0.7%、2.2%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下的溶液，分別在配制后0,2,4,8,12,16,20, 24 h，按上述色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果維生素B1、維生素B2、維生素B6的峰面積RSD分別為0.2%、0.6%、0.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7回收率測定

取本品細(xì)粉（批號：110108，維生素B1、維生素B2、維生素B6含量分別為1.112mg/g、0.139mg/g、0.074 5 mg/g）2.5 g，共9份，精密稱定，分別置50mL量瓶中，分別精密加入維生素B1對照品溶液（濃度為0.622 9mg/ML）4m L、5mL、6mL，維生素B2對照品溶液（濃度為0.087 74mg/ML）4mL、5mL、6mL，維生素B6對照品溶液（濃度為0.0829mg/mL）2 ML、2.5 ML、3 ML，加水-乙腈-冰醋酸（94:5:1）混合溶液適量，振搖使溶解，置70℃水浴中振蕩1 h，冷卻至室溫，加水-乙腈-冰醋酸（94:5:1）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，結(jié)果維生素B1、維生素B2、維生素B6的平均回收率依次為100.2%，100.9%，98.6%，RSD依次為0.3%，0.5%，1.8%(n=9)。

2.8樣品測定

取收集到的6批樣品，按所述方法測定維生素B1、維生素B2、維生素B6含量，結(jié)果見表1。

表1　樣品測定結(jié)果（Mg/g）

3　討論

3.1檢測波長的選擇

分別維生素B1、維生素B2、維生素B6對照品的水-乙腈-冰醋酸（94：5：1）溶液適量，適當(dāng)稀釋，經(jīng)UV-1700紫外-可見分光光度計(jì)在波長200～600 nm范圍內(nèi)測定其紫外吸收光譜，測得維生素B1在246.7 nm、維生素B2在445.6 nm和266.5 nm、維生素B6在291 nm的波長處有最大吸收。由于維生素B6在三組分中含量最低，為保證各組分均有適當(dāng)?shù)捻憫?yīng)值，同時(shí)參考有關(guān)文獻(xiàn)[3]，選擇280 nm為檢測波長。

3.2流動(dòng)相的選擇

參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，考察了以下3種流動(dòng)相系統(tǒng)：①三乙胺-冰醋酸-甲醇-0.008mol/L己烷磺酸鈉（0.2:7.5: 220:775）；②0.05 mol/L磷酸二氫鉀-水-乙腈-甲醇（0.5: 79.5:5:15）；③庚烷磺酸鈉溶液(取庚烷磺酸鈉0.6 g, 1000 mL水溶解,加三乙胺2.8 mL,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)-甲醇(體積比6∶1)；④醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)-甲醇(65∶35)。經(jīng)試驗(yàn)：流動(dòng)相①維生素B1、維生素B2、維生素B6三組分分離度較好，雜質(zhì)峰無干擾；流動(dòng)相②、④維生素B6峰前后均存在雜質(zhì)干擾；流動(dòng)相③也能使三組分有效分離，但配制過程較為復(fù)雜，且維生素B1、維生素B2保留時(shí)間過長，峰形不好。故選擇流動(dòng)相系統(tǒng)①，同時(shí)測定維生素B1、維生素B2、維生素B6的含量。

3.3提取溶劑、提取條件及操作條件的選擇

由于維生素B1、維生素B2、維生素B6均為水溶性維生素，同時(shí)考慮到維生素B2的穩(wěn)定性，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，考察水、水-冰醋酸（99:1）、水-乙腈-冰醋酸（94:5:1）3種溶劑在70℃水浴中振蕩加熱和100℃水浴中時(shí)時(shí)振搖的提取效果，結(jié)果表明以水為提取溶劑提取不完全；以水-冰醋酸（99:1）為提取溶劑，70℃水浴中振蕩加熱提取不完全，100℃水浴中振蕩加熱雜質(zhì)量較高，干擾測定；以水-乙腈-冰醋酸（94:5:1）為提取溶劑，在70℃水浴中振蕩加熱1 h的提取效果最好，且雜質(zhì)較少；由于維生素B2具有遇光不穩(wěn)定性，故操作過程中需要避光操作。

[參考文獻(xiàn)]

[1]（國家藥品標(biāo)準(zhǔn)）化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)第七冊.五維賴氨酸顆粒[S].2002(7):23.

[2]劉敏，李玉蘭.HPLC法測定五維賴氨酸顆粒中四種維生素的含量[J].中國藥事,2006,9（7）：593-595.

[3]李鋒武,劉鵬鳴,黃潔,等.HPLC法測定八維鈣鋅片中煙酰胺、維生素B1、B2、B6的含量[J].藥物分析雜志,2011,31(6): 1150-1152.

[4]王琛,陳彬彬,鄒梅娟,等.HPLC法同時(shí)測定多維元素膠囊中煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2的含量[J].海峽藥學(xué),2010,22(3):52-55.

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[中圖分類號]R927

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1672-5654（2015）10（b）-0140-03

DOI：10.16659/j.cnki.1672-5654.2015.29.140

收稿日期：（2015-07-18）

[作者簡介]孫晶晶（1982.9-），女，遼寧沈陽人，本科，主管藥師，主要從事藥品的檢驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的起草、復(fù)核工作。

Determ ination of vitam in B1、vitam in B2、vitam in B6in Five Vitam ins and Lysine Granules by HPLC

SUN Jing-jing1，SUN Jia-ling1,SUN Qiu2
Jilin Provincial Institute for Drug Control，Changchun，Jilin Province，130033 China;2.Baicheng Institute for Food and Drug Control，Baicheng，Jilin Province，137000 China

[Abstract]Objective To establish an HPLCmethod for determination of vitamin B1、vitamin B2、vitam in B6in Five Vitamins and Lysine Granules.Methods HPLC was performed on an Agela-C18 column,and themobile phase was themixture of triethylamine-glacial acetic acid-methanol-8mmol/Lsodium hexanesulfonate solution（0.2:7.5：220:775）at a flow rate of 1.0 mL/min；The detective wavelength was 280nm.Resu lts The calibration curve of vitamin B1、vitamin B2、vitamin B6respectively was in good linearity over the range of 0.6229-7.4748μg（r=1.000）、0.0877-1.0529μg（r=1.000）、0.04145-0.4974 μg（r=1.000）and the average recovery was 100.2%（RSD:0.3%）、100.9%（RSD:0.5%）、98.6%（RSD:1.8%）.Conclusion The method is simple，accurate，and can be used for the determination of vitamin B1、vitamin B2、vitamin B6in Five Vitamins and Lysine Granules.

[Key words]HPLC；Five Vitamins and Lysine Granules；Content