應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取繡球菌多糖工藝

洪小君，林端權(quán)，王春蓮，張?jiān)雒?，王益晨，鄭明鋒

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002)

繡球菌(Sparassis crispa)又名繡球菇、花瓣覃、花椰菜菌等，是藥食兩用菌［1］，具有抗腫瘤、抗病毒、促進(jìn)人體新陳代謝、降低血壓血脂、提高造血及免疫調(diào)節(jié)等功能［2－6］。多糖是繡球菌多種生理功能的最主要活性成分之一，其中以葡聚糖含量最高，可達(dá)40% －50%［7－8］。因此，提取繡球菌多糖具有良好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

酶法提取條件比熱水浸提或酸法提取更為溫和，不易引起多糖分子的降解，且能顯著提高多糖提取率［9］。本文采用3 種酶復(fù)合協(xié)同輔助繡球菌多糖的提取，并進(jìn)一步應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以提高繡球菌多糖提取率，為繡球菌的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

1.1.1 原料 繡球菌子實(shí)體由福州市福清火麒麟食用菌有限公司提供。

1.1.2 設(shè)備 UV-1800PC 型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);XH-B 漩渦振蕩儀(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司);低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠);KD-1000KC 型電子分析天平(奧豪斯儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖提取及測(cè)定 將洗凈的繡球菌子實(shí)體經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥，超微粉碎處理(過(guò)200 目篩)。干粉用緩沖液溶解并稱取適量復(fù)合酶加入溶液中?；靹蚝螅銣厮∶附?80 min，滅酶，離心，上清液經(jīng)濃縮加入其3 倍體積的95%乙醇溶液，4 ℃靜置過(guò)夜，離心取沉淀。沉淀用無(wú)水乙醇洗滌后復(fù)溶，采用苯酚—硫酸法［10］進(jìn)行多糖測(cè)定。測(cè)得的吸光度值通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成葡萄糖質(zhì)量，計(jì)算粗多糖提取率。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線［11］，本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y =9.9675x +0.0572，R2=0.9974。

1.2.3 酶解工藝的優(yōu)化 (1)酶解條件單因素試驗(yàn)。取適量繡球菌干粉，加入復(fù)合酶(纖維素酶0.6%、果膠酶0.6%、木瓜蛋白酶0.6%)，酶解，固定其他條件，分別考察酶解pH 值(3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8)、酶解時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、酶解溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)等對(duì)多糖提取率的影響。每組平行3 次試驗(yàn)，取平均值。

(2)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合(central composite)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行4 因素3 水平試驗(yàn)，并對(duì)31 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)加以響應(yīng)面分析。試驗(yàn)因子及水平編碼如表1 所示，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of the central composite-design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH 值 由圖1 可知，繡球菌多糖提取率隨著酶解pH 值的不斷增大，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在pH 值為4.2 時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值，之后提取率逐漸降低。pH 值不僅影響酶活性，也影響酶的催化反應(yīng)速度。在適宜的pH 下通過(guò)靜電作用，酶活性中心的最佳三維構(gòu)象得以較好維持，而在過(guò)酸或過(guò)堿條件下，酶和底物所帶電荷、親和力、酶的空間結(jié)構(gòu)都會(huì)受到破壞，影響了酶與底物的結(jié)合［12］，從而使多糖提取率下降，故選擇pH 值為4.2。

2.1.2 酶解時(shí)間 由圖2 可知，繡球菌多糖提取率在酶解時(shí)間達(dá)到3 h 后未繼續(xù)增高，說(shuō)明酶解的充分性與酶解時(shí)間密切相關(guān)。長(zhǎng)時(shí)間的酶解將菌體中的物質(zhì)溶出，達(dá)到了溶解平衡，即使酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)也無(wú)法顯著提高多糖提取率。因此，考慮到實(shí)際操作及防止多糖水解，選用3 h 作為最佳酶解時(shí)間。

2.1.3 酶解溫度 由圖3 可知，隨著酶解溫度的提高，多糖提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，50 ℃時(shí)多糖提取率達(dá)到最高。由于酶解溫度不僅影響酶催化反應(yīng)速率，而且影響酶的活性，溫度太低無(wú)法催化酶解反應(yīng)，溫度過(guò)高則會(huì)使酶活力減弱、變性、失活，甚至導(dǎo)致多糖變性，從而使得多糖提取率下降［13］。故本研究選擇最佳酶解溫度為50 ℃。

2.1.4 液料比 由圖4 可知，繡球菌多糖提取率隨著液料比增大不斷升高，當(dāng)液料比達(dá)到15∶1 時(shí)，多糖提取率最高，之后呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。究其原因，可能由于加水太少則提取不徹底;加水太多，反應(yīng)濃度降低，酶和底物結(jié)合的概率大大減小，從而使得浸提出的多糖量減少。因此，本研究選用15∶1 作為最佳液料比。

圖1 pH 值對(duì)繡球菌多糖提取率的影響Fig.1 Effect of pH value on the polysaccharide extraction rate

圖2 酶解時(shí)間對(duì)繡球菌多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the polysaccharide extraction rate

圖3 酶解溫度對(duì)繡球菌多糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the polysaccharide extraction rate

圖4 液料比對(duì)繡球菌多糖提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the polysaccharide extraction rate

2.2 應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化繡球菌多糖最佳提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果1)Table 2 The design and results of the response surface analysis

2.2.1 回歸模型的建立與檢測(cè) 對(duì)表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后，得到回歸方程為:

對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，該模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著(P ＞0.05)，決定系數(shù)R2為0.9890，說(shuō)明該回歸方程擬合度和可信度均很高，使用該方程模擬真實(shí)的四因子五水平的分析可行。在α=0.05 水平上，對(duì)指標(biāo)值具有顯著交互作用影響的為:X1X2、X1X4、X2X3、X3X4。剔除不顯著項(xiàng)，簡(jiǎn)化后的回歸方程為:Y = 14.14429 －0.09833X1+0.19417X2+0.25417X3+0.10583X4－0.18899X21－0.18024X22－0.24149X23－0.28274X24+0.05750X1X2－0.04000X1X4+0.14125X2X3－0.08625X3X4。

表3 回歸模型方差分析1)Table 3 The variance analysis of the regression model

2.2.2 因素間交互效應(yīng)分析 由表3 可知，在α =0.05 水平上，交互項(xiàng)X1X2、X1X4、X2X3、X3X4對(duì)提取率均有顯著交互作用影響(圖5 －8)。

圖5 酶解pH 值與酶解時(shí)間對(duì)繡球菌多糖提取率的影響Fig.5 Effects of the pH value and time on polysaccharide extraction yield

對(duì)比響應(yīng)面的三維立體圖，在試驗(yàn)所選的范圍內(nèi)有極值，即響應(yīng)面出現(xiàn)最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。從圖5 可見(jiàn)，在時(shí)間適中的情況下，pH 較高或較低都會(huì)影響多糖的提取率。而在特定的pH 下隨著酶解的進(jìn)行即使提高溫度，多糖提取率也未呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。從圖6 可見(jiàn)，在－2 到0 水平，多糖提取率均隨著液料比和pH 值的提高呈現(xiàn)逐漸上升的的趨勢(shì)，大于0 水平的情況下不利于多糖的溶出。溫度對(duì)多糖提取率的影響大于時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響(圖7)。在特定的液料比和溫度下，多糖提取率均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)(圖8)。

圖6 pH 值與液料比對(duì)繡球菌多糖提取率的影響Fig.6 Effects of the pH value and liquid-to-solid ratio on polysaccharide extraction yield

圖7 酶解溫度與酶解時(shí)間對(duì)繡球菌多糖提取率的影響Fig.7 Effects of the time and temperature on polysaccharide extraction yield

圖8 酶解溫度與液料比對(duì)繡球菌多糖提取率的影響Fig.8 Effects of the temperature and liquid-to-solid ratio on polysaccharide extraction yield

基于以上分析可知，pH 值在4.2 左右、酶解時(shí)間3.0 －3.5 h、酶解溫度50 －55 ℃、料液比在1∶14 －1∶16 之間，多糖提取率較高。總的來(lái)看，4 個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)多糖提取率的影響不僅僅是單一的線性關(guān)系，平方項(xiàng)以及交互項(xiàng)之間對(duì)響應(yīng)值也有較大的影響。

2.2.3 最佳條件及驗(yàn)證結(jié)果 對(duì)所建立的回歸模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為:酶解pH 值4.16、酶解時(shí)間3.41 h、酶解溫度53.73 ℃、液料比15.63∶1，在此條件下多糖提取率可達(dá)14.33%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面模型結(jié)果的可靠性，對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證?？紤]實(shí)際操作，選取酶解pH 值4.2、酶解時(shí)間3.4 h、酶解溫度54 ℃、液料比16∶1 為條件，重復(fù)3 次，實(shí)測(cè)平均提取率為:14.12% ±0.52%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，表明該回歸模型具有較好的預(yù)測(cè)性，提取參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 小結(jié)

本研究采用纖維素酶(0.6%)、果膠酶(0.4%)和木瓜蛋白酶(0.6%)復(fù)合提取繡球菌多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法建立多糖提取率與酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH 值、液料比之間的二次回歸模型，通過(guò)回歸方程優(yōu)化獲得了最佳提取工藝參數(shù)為:酶解pH 值4.16、酶解時(shí)間3.41 h、酶解溫度53.73℃、液料比15.63∶1。在此條件下提取率可達(dá)(14.12% ±0.52%)，與預(yù)測(cè)值(14.33%)基本一致。綜合來(lái)看，本模型具有較好的預(yù)測(cè)性能，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的借鑒意義。

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