BTLA與HVEM相互作用對(duì)T細(xì)胞活化的影響

王蕓蕓，蔣玉平，張標(biāo)，顧宗江

（1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)系，江蘇蘇州215007；2.鹽城市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇鹽城224005）

BTLA與HVEM相互作用對(duì)T細(xì)胞活化的影響

王蕓蕓1，蔣玉平2，張標(biāo)1，顧宗江1

（1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)系，江蘇蘇州215007；2.鹽城市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇鹽城224005）

目的：探討小鼠髓系樹突狀細(xì)胞（BMDC）上HVEM與T細(xì)胞上BTLA相互作用對(duì)T細(xì)胞活化的影響。方法：C57BL/6小鼠的BMDC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)，HVEM抗體封閉BMDC上的HVEM后，采用MTT法檢測T細(xì)胞的活化增殖，ELISA試劑盒檢測IL-2的分泌。結(jié)果：混合培養(yǎng)的啟動(dòng)和早期（0～48 h）、中晚期（48～96 h）以及全程（0～96 h），加入HVEM抗體實(shí)驗(yàn)組的T細(xì)胞增殖效應(yīng)均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），同時(shí)CD3+T細(xì)胞組和CD4+T細(xì)胞組IL-2的分泌明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：BTLA-HVEM相互作用產(chǎn)生的負(fù)性信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的活化起抑制作用，特別是在BMDC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)的啟動(dòng)和早期（0～48 h），BTLA負(fù)性信號(hào)就有抑制T細(xì)胞活化的作用，有別于傳統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制，提示T細(xì)胞的活化可能存在多種負(fù)性調(diào)節(jié)模式。

BTLA；T細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)

BTLA（B and T lymphocyte attenuator）是進(jìn)行基因篩選時(shí)，在T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)負(fù)性共分子，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為34.5×103，具有免疫球蛋白可變區(qū)（IgV）樣結(jié)構(gòu)域的胞外段、跨膜區(qū)和100個(gè)氨基酸組成的胞內(nèi)段。其中胞內(nèi)段具有3個(gè)重要的含酪氨酸殘基的基序，分別為Grb2結(jié)合基序、免疫受體酪氨酸抑制基序和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化基序，表明BTLA具有與CTLA和PD-1相似的結(jié)構(gòu)［1-4］。最初推測B7x可能是BTLA的配體，然而缺乏兩者結(jié)合的直接證據(jù)。以后研究證實(shí)，TNF受體超家族成員HVEM（herpesvirus entrymediator）是BTLA的配體。HVEM與BTLA結(jié)合，可以誘導(dǎo)BTLA胞內(nèi)酪氨酸磷酸化，進(jìn)而招募磷酸酶SHP-1和SHP-2，抑制T細(xì)胞的活化［5-9］。HVEM作為受體又可結(jié)合TNF超家族成員LIGHT，傳遞促進(jìn)T細(xì)胞活化的正向信號(hào)［10-12］。BTLA、HVEM和LIGHT表達(dá)在多種免疫細(xì)胞上，同時(shí)又受到細(xì)胞活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)［13-14］。這種復(fù)雜的表達(dá)方式和正負(fù)信號(hào)交織使得T細(xì)胞的免疫應(yīng)答受到更精確的調(diào)節(jié)。因此，對(duì)BTLA在T細(xì)胞上的負(fù)性調(diào)節(jié)作用的研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抗小鼠HVEM多抗、rmGM-CSF和rm IL-4（R&D公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（FCS，杭州四季青公司）；CD11c-FITC抗體（eBioscience公司）；淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll，上海生化試劑二廠）；CD11c、CD3、CD4和CD8小鼠陽性磁珠分選試劑盒（Stemcell公司）；流式細(xì)胞儀（Altra，Beckman-Coulter公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。6～8周齡的C57BL/6小鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠髓系樹突狀細(xì)胞（BMDC）的誘導(dǎo)及純化 無菌取6～8周C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞，經(jīng)Tris-NH4Cl低滲溶解紅細(xì)胞，PBS洗滌2遍后調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，于含10 ng/mL rmGM-CSF和4 ng/mL rm IL-4的RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素）的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天半量換液，再培養(yǎng)2～3 d，收集非貼壁細(xì)胞，用CD11c-FITC抗體標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，然后按照磁珠分選試劑盒的說明，以CD11c陽性分選磁珠進(jìn)行分選并獲取BMDC，簡稱DC。

1.2.2 小鼠脾臟T細(xì)胞的獲取與純化 無菌取6～8周C57BL/6小鼠脾臟，使用5 mL注射器沖洗出脾臟細(xì)胞，PBS洗2遍。Tris-NH4Cl低滲溶解紅細(xì)胞后，用Ficoll分離出淋巴細(xì)胞，按照磁珠分選試劑盒的說明，分別以CD3、CD4和CD8磁珠進(jìn)行陽性分選，獲得CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞。

1.2.3 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 將純化后的DC以1× 104/孔、T細(xì)胞以1.5×105/孔密度加入96孔板。加HVEM抗體的DC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分為3組：一組加入HVEM抗體后培養(yǎng)4 d；一組加入HVEM抗體后培養(yǎng)2 d；最后一組不加抗體培養(yǎng)2 d，再加入HVEM抗體繼續(xù)培養(yǎng)2 d。各組HVEM抗體的質(zhì)量濃度為10 ng/mL。同時(shí)設(shè)置加同型IgG的DC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)對(duì)照組。以上各組根據(jù)T細(xì)胞的不同，每組又細(xì)分為CD3+T細(xì)胞組、CD4+T細(xì)胞組和CD8+T細(xì)胞組，各組均設(shè)置單獨(dú)DC和T細(xì)胞對(duì)照組。

1.2.4 T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子IL-2檢測 以上各組按規(guī)定時(shí)間培養(yǎng)后，離心吸取上清用于IL-2的檢測，然后各組加入20μL MTT溶液（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心并吸棄上清，每孔用PBS洗滌2次后，加入100μL DMSO徹底溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀上于570 nm波長比色。IL-2的檢測采用ELISA檢測試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作，不同組別待檢上清均設(shè)復(fù)孔進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC的誘導(dǎo)與培養(yǎng)結(jié)果

C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)過rmGM-CSF和rm IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞體積變大，出現(xiàn)成團(tuán)現(xiàn)象，部分細(xì)胞出現(xiàn)樹突狀突起，吸取非貼壁細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，CD11c+的細(xì)胞可達(dá)50%～68%。經(jīng)磁珠陽性選擇法分選純化后，所得細(xì)胞在鏡下觀察呈典型的DC形態(tài)特征。

2.2 HVEM抗體阻斷BTLA-HVEM相互作用，增強(qiáng)T細(xì)胞的活化增殖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)T細(xì)胞與DC相互作用時(shí)，加入HVEM抗體培養(yǎng)4 d、加入HVEM抗體培養(yǎng)2 d、先不加抗體培養(yǎng)2 d后再加入HVEM抗體繼續(xù)培養(yǎng)2 d的各實(shí)驗(yàn)組的MTT光密度（D）值均高于同組對(duì)照組的D值（圖1、2、3），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明加入HVEM抗體阻斷了BTLA-HVEM相互作用向T細(xì)胞傳導(dǎo)的負(fù)性抑制信號(hào)，使得T細(xì)胞的活化增殖加強(qiáng)。加入HVEM抗體培養(yǎng)2 d的實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，BTLA-HVEM相互作用產(chǎn)生的負(fù)性抑制信號(hào)在T細(xì)胞活化的啟動(dòng)和早期階段（0～48 h）即可發(fā)揮效應(yīng)。與對(duì)照組相比，先不加抗體培養(yǎng)2 d后再加入HVEM抗體繼續(xù)培養(yǎng)2 d的實(shí)驗(yàn)組也出現(xiàn)了T細(xì)胞活化增殖的加強(qiáng)（圖3），說明T細(xì)胞活化的中晚期（48～96 h）也受到BTLAHVEM相互作用的負(fù)性信號(hào)影響。與加HVEM抗體只培養(yǎng)2天的實(shí)驗(yàn)組相比（圖1，2），加HVEM抗體培養(yǎng)4 d的實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞的增殖效應(yīng)更強(qiáng)，顯示出BTLA-HVEM的負(fù)性信號(hào)在T細(xì)胞活化的全程都發(fā)揮作用，包括啟動(dòng)和早期活化階段。

圖1 加入HVEM抗體培養(yǎng)4 d后，T細(xì)胞的活化增殖

圖2 加入HVEM抗體培養(yǎng)2 d后，T細(xì)胞的活化增殖

圖3 培養(yǎng)2 d后加入HVEM抗體繼續(xù)培養(yǎng)2 d，T細(xì)胞的活化增殖

2.3 HVEM抗體阻斷BTLA-HVEM相互作用，增加IL-2的分泌

在T細(xì)胞與DC混合培養(yǎng)時(shí)，CD3+T細(xì)胞組和CD4+T細(xì)胞組中加入HVEM抗體的實(shí)驗(yàn)組上清中的IL-2分泌量均高于同組對(duì)照組（圖4、5、6），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），上述結(jié)果說明，阻斷BTLA負(fù)性信號(hào)可減弱對(duì)IL-2分泌的抑制，導(dǎo)致活化T細(xì)胞IL-2分泌增加。但CD8+T細(xì)胞組分泌的IL-2很低，即使阻斷BTLA負(fù)性信號(hào)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間IL-2的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 加入HVEM抗體培養(yǎng)4 d后，培養(yǎng)上清中IL-2的含量

圖5 加入HVEM抗體培養(yǎng)2 d后，培養(yǎng)上清中IL-2的含量

圖6 培養(yǎng)2 d后加入HVEM抗體繼續(xù)培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)上清中IL-2的含量

3 討論

BTLA是B7-CD28家族中發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)抑制性分子，具有與CTLA-4和PD-1相似的結(jié)構(gòu)。經(jīng)典的觀點(diǎn)認(rèn)為，CTLA-4和PD-1在靜止T細(xì)胞上不表達(dá)，在雙信號(hào)的作用下，T細(xì)胞被激活并在活化的中晚期表達(dá)CTLA-4和PD-1分子，從而通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，收縮免疫應(yīng)答，防止T細(xì)胞應(yīng)答過強(qiáng)和過度，因此T細(xì)胞活化的負(fù)反饋調(diào)節(jié)被公認(rèn)為免疫系統(tǒng)自穩(wěn)的重要機(jī)制。BTLA組成性高表達(dá)在靜止T細(xì)胞并且活化后繼續(xù)表達(dá)，BTLA分子的發(fā)現(xiàn)者M(jìn)urphy根據(jù)這一特點(diǎn)在2006年提出［13］，BTLA可能在T細(xì)胞活化的各個(gè)階段（包括啟動(dòng)和早期階段）發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這是一個(gè)重要的理論命題，也是一個(gè)重要的科學(xué)問題，因?yàn)楝F(xiàn)有關(guān)于T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)的理論，僅有負(fù)反饋調(diào)節(jié)理論，是否存在其他負(fù)性調(diào)節(jié)模式，尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。2009年Miller等［15］證實(shí)BTLA信號(hào)可以在免疫應(yīng)答的早期抑制NKT細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和對(duì)肝臟組織的損傷。NKT細(xì)胞是T細(xì)胞中的一個(gè)小的亞群，主要參與固有免疫應(yīng)答。對(duì)于主要參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的大量其他T細(xì)胞群體，仍然沒有見到BTLA信號(hào)是否在啟動(dòng)和早期階段對(duì)這些T細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)的文獻(xiàn)報(bào)道，這一科學(xué)問題仍然沒有解決。因此，Murphy等［14］于2010年再次提出BTLA信號(hào)可能在T細(xì)胞活化的各個(gè)階段均可發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。但時(shí)至今日，在國際上仍然沒有學(xué)者涉足這一重要科學(xué)問題。我們以前在人T細(xì)胞上的研究結(jié)果，初步證實(shí)了BTLA信號(hào)可在T細(xì)胞活化起始和早期階段發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用［16］，本文結(jié)果初步證實(shí)了BTLA信號(hào)也可在小鼠T細(xì)胞活化起始和早期階段發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，說明在T細(xì)胞活化啟動(dòng)時(shí)，不僅有正向的第一、第二信號(hào)參與，也有BTLA相關(guān)的負(fù)性信號(hào)參與，對(duì)第一、第二信號(hào)發(fā)揮拮抗作用。上述現(xiàn)象實(shí)質(zhì)上是T細(xì)胞活化（或者說T細(xì)胞免疫應(yīng)答）的經(jīng)典負(fù)反饋調(diào)節(jié)模式之外的另一嶄新的負(fù)性調(diào)節(jié)模式，即提高T細(xì)胞活化啟動(dòng)閾值來抑制T細(xì)胞活化。如果這種嶄新的負(fù)性調(diào)節(jié)模式最終得到確證，提示經(jīng)典的T細(xì)胞活化的雙信號(hào)學(xué)說理論存在缺陷，需要修正和完善。

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Effect of interaction between BTLA and HVEM on T cell activation

WANG Yun-yun1，JIANG Yu-ping2，ZHANG Biao1，GU Zong-jiang1
（Department of Immunology，School of Biology and Basic Medical Science，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215007；2.Yancheng Products Quality Supervision and Test Institute，Yancheng Jiangsu 224005，China）

Objective：To investigate the effect of interaction between B and T lymphocyte attenuator（BTLA）and HVEM ofmouse bonemarrow-derived dendritic cells（BMDC）on T cell activation.M ethods：T cells and BMDC from C57BL/6 mouse weremixed and cultured.After blocking HVEM on BMDC by antibodies against HVEM，MTTmethod was used to examine T cell proliferation and the secretion of IL-2 was tested by ELISA kit.Results：In the priming and early phase（0-48 h），ormiddle and later phase（48-96 h），or all phase（0-96 h）ofmixing culture，the proliferation of T cells from experimental groupswith addition of HVEM antibodieswas higher compared with control groups（P＜0.05），and the secretion of IL-2 from CD3+T cell and CD4+T cell groups was also higher compared with control groups（P＜0.05）.Conclusion：The negative signal produced by interaction between BTLA and HVEM played the inhibition role in T cell activation.Especially in the priming and early phase（0-48 h）ofmixing culture of T cells and BMDC，the negative signal from BTLA already played such inhibition role，exhibiting another negative regulation mode different from traditional negative feedback regulation mode and suggesting the existence of multiple negative regulation for T cell activation.

B and T lymphocyte attenuator；T cell；immune regulation

R392

A

1671-7783（2015）04-0290-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150106

王蕓蕓（1988—），女，碩士研究生；顧宗江（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：suguzj@163.com

2015-05-12 ［編輯］ 何承志