UPLC法測(cè)定咖啡豆中綠原酸和咖啡因的含量

楊清山，蔡榮華，徐　猛，王　磊，高　偉，*（.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北邯鄲05750；.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲05750）

UPLC法測(cè)定咖啡豆中綠原酸和咖啡因的含量

楊清山1，2，蔡榮華1，徐猛2，王磊1，2，高偉1，2，*
（1.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北邯鄲057250；2.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲057250）

摘要：建立了咖啡豆中綠原酸和咖啡因的超高效液相色譜測(cè)定方法。咖啡豆粉碎后經(jīng)70%甲醇水溶液超聲提取后，在Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）上以酸性乙腈水為流動(dòng)相，采用紫外檢測(cè)器在274 nm測(cè)定。在優(yōu)化試驗(yàn)條件下，咖啡豆中綠原酸和咖啡因提取完全。綠原酸在88.4 mg/L～442 mg/L時(shí)峰強(qiáng)度與濃度成良好線性（r2= 0.999 3），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.81%，平均回收率為98.24%～99.72%?？Х纫蛟?8.8 mg/L～143 mg/L時(shí)峰強(qiáng)度與濃度成良好線性（r2=0.999 8），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.34%，平均回收率為98.50%～101.32%。方法準(zhǔn)確可靠，適用于咖啡豆中綠原酸和咖啡因含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：咖啡豆；綠原酸；咖啡因；UPLC

咖啡樹是屬茜草科多年生灌木或小喬木，而咖啡豆就是指咖啡樹果實(shí)里面的果仁。常飲用的咖啡是用咖啡豆配合各種不同的烹煮器具制作出來的?！翱Х取保╟offee）一詞源自埃塞俄比亞的一個(gè)名叫卡法（kaffa）的小鎮(zhèn)，在希臘語中“Kaweh”的意思是“力量與熱情”?？Х群胸S富的活性物質(zhì)，其中綠原酸類化合物占咖啡豆干重0.2%～10%，咖啡因占2%～8%左右[1]。綠原酸是一類與人類健康密切相關(guān)的生理活性物質(zhì)，其中以5-咖啡?？崴幔?-O-caffeoylquinic acid，5-CQA）為主要成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，綠原酸類化合物具有抗氧化、抗病毒、抗癌等多種作用，同時(shí)對(duì)高血脂、高血壓和動(dòng)脈硬化硬化具有一定抑制作用[2-5]?？Х纫蛴址Q咖啡堿，在醫(yī)藥上可作麻醉劑、興奮劑、利尿劑和強(qiáng)心劑[6]。龍文靜等研究了咖啡豆中的綠原酸類化合物測(cè)定方法[7]，賈桂燕等研究了咖啡中綠原酸和咖啡因的測(cè)定方法[8]，李春麗等研究了咖啡豆中咖啡因的測(cè)定方法[9]。本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定咖啡豆中綠原酸和咖啡因的超高效液相色譜法，方法簡(jiǎn)單快捷、穩(wěn)定可靠，為咖啡豆的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters超高效液相色譜儀，配有紫外檢測(cè)器和ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)：美國Waters公司；BP211D電子天平：德國賽多利斯公司；FZ102微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；Millipore Q超純水器：美國Millipore公司；TH-300BQ數(shù)控超聲波清洗器：濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司。

圖1　綠原酸和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1　Chromatogram of chlorogenic acid and caffeine

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購買于貴州迪大生物科技有限公司，純度98%；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品購買于中國計(jì)量科學(xué)研究院，純度99.8%；冰醋酸、甲醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純）：美國Fisher公司。

咖啡豆樣品：晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司提供。

1.2色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度：20℃；進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相：10%乙腈水（冰醋酸調(diào)pH 2.75）；流速0.4 mL/min；檢測(cè)波長：274 nm。

1.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取單酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品5 mg 至50 mL容量瓶中，用10%乙腈水定容，搖勻作為儲(chǔ)備液；用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，依次稀釋2、4、8、16、32倍，作為標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4樣品溶液的制備

將咖啡豆粉碎至40目通過率80%以上細(xì)度，并將篩上物和篩下物混合均勻后，作為待測(cè)樣。準(zhǔn)確稱取1.000 g待測(cè)樣，置于100 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，室溫下超聲2 h，冷卻后過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣檢測(cè)。

和咖啡因均具有吸收，因此確定檢測(cè)波長為274nm。

2.2樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1粉碎細(xì)度的選擇

咖啡豆在不同粉碎次數(shù)下的40目篩過篩率情況見表1。

表1　咖啡豆粉碎試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1　Data of coffee bean by smash test

咖啡豆質(zhì)地較硬，常規(guī)粉碎方法無法滿足試驗(yàn)要求，使稱取的樣品無法具有代表性或者粒度過大影響萃取效果，造成最終檢測(cè)誤差偏大。本試驗(yàn)采取多次粉碎過篩的方式，將咖啡豆粉碎至40目通過率80%以上，使每次稱取的樣品都具有代表性且樣品在萃取過程達(dá)到最佳的效果。

2.2.2提取溶劑的選擇

不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇對(duì)咖啡豆粉的提取效果情況見圖2。

圖2　甲醇濃度優(yōu)化試驗(yàn)Fig.2　Optimizing test of methanol concentration

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)波長的選擇

綠原酸和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

咖啡因最大吸收波長為272nm，綠原酸最大吸收波長為327nm，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在274nm波長條件下，綠原酸

試驗(yàn)分別進(jìn)行了30%、50%、70%和100%甲醇對(duì)咖啡豆粉中綠原酸和咖啡因的提取效果情況。結(jié)果表明，70%甲醇提取出的綠原酸和咖啡因含量均高于其他幾種提取溶劑，因此選擇70%甲醇作為提取溶劑。

2.2.3提取時(shí)間的選擇

不同超聲時(shí)間對(duì)咖啡豆粉的提取效果情況見圖3。

圖3　提取時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)Fig.3　Optimizing test of extraction time

試驗(yàn)分別進(jìn)行了超聲輔助提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h對(duì)咖啡豆粉中綠原酸和咖啡因的提取效果情況。結(jié)果表明，超聲輔助提取2.0 h的提取效果最好，因此選擇超聲輔助提取2.0 h作為最佳提取時(shí)間。

2.2.4稱樣質(zhì)量的選擇

不同稱樣質(zhì)量對(duì)咖啡豆粉的提取效果情況見圖4。

圖4　稱樣質(zhì)量?jī)?yōu)化試驗(yàn)Fig.4　Optimizing test of sample weigh

試驗(yàn)分別進(jìn)行了樣品稱取質(zhì)量為0.500、1.000、2.500、5.000 g對(duì)咖啡豆粉中綠原酸和咖啡因的提取效果情況。結(jié)果表明，稱樣質(zhì)量為1.000 g時(shí)的提取效果最好，因此選擇稱樣質(zhì)量1.000 g作為最佳稱樣量。

2.3線性關(guān)系和檢出限

取“1.3”中的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按照“1.2”條件下檢測(cè)，進(jìn)行線性范圍考察，以綠原酸和咖啡因的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：綠原酸在88.4 mg/L～442 mg/L時(shí)峰強(qiáng)度與濃度成良好線性，線性方程為y=4966567x-20076，r2=0.999 3；咖啡因在28.8 mg/L～143 mg/L時(shí)峰強(qiáng)度與濃度成良好線性，y=19 734 680x-55 406，r2=0.999 8。

2.4精密度試驗(yàn)

取“1.3”中的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按照“1.2”條件下進(jìn)樣檢測(cè)，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明：標(biāo)樣中綠原酸和咖啡因的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.91%和0.68%。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

選取同一份樣品，用“1.4”中方法進(jìn)行制樣，按照“1.2”條件下進(jìn)樣檢測(cè)，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，樣品重復(fù)檢測(cè)6次，測(cè)定樣品中綠原酸和咖啡因含量。結(jié)果表明：樣品中綠原酸和咖啡因的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.81% 和1.34%。

2.6加標(biāo)回收率試驗(yàn)

選取同一份樣品，分別在其濃度附近進(jìn)行加標(biāo)，用“1.4”中方法進(jìn)行制樣，按照“1.2”條件下進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定樣品中綠原酸和咖啡因加標(biāo)回收率情況。結(jié)果表明：樣品中綠原酸和咖啡因的加標(biāo)回收率分別為98.24%～99.72%和98.50%～101.32%。

3　結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)確定了一種簡(jiǎn)單、快速并能準(zhǔn)確測(cè)定咖啡豆中綠原酸和咖啡因含量的超高效液相色譜方法，為咖啡豆質(zhì)量的評(píng)定提供參考方法。

本試驗(yàn)方法經(jīng)精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等試驗(yàn)驗(yàn)證，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)，說明該處理方法及色譜條件適用于咖啡豆中綠原酸和咖啡因的定量分析，方法準(zhǔn)確可靠。

本試驗(yàn)建立的綠原酸檢測(cè)方法只適用于咖啡豆中主要成分5-咖啡?？崴幔?-O-caffeoylquinic acid，5-CQA）的含量測(cè)定，對(duì)于咖啡豆中所有綠原酸成分和咖啡因含量的同時(shí)測(cè)定需要其他學(xué)者做進(jìn)一步研究。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.035

收稿日期：2013-12-21

基金項(xiàng)目：國家國際科技合作專項(xiàng)（S2013ZR0319）

作者簡(jiǎn)介：楊清山（1985—），男（漢），工程師，學(xué)士，研究方向：食品分析和檢測(cè)。

*通信作者：高偉，博士，高級(jí)工程師，研究方向：天然產(chǎn)物提取。

Determination of Chlorogenic Acid and Caffeine in Coffee Beans by UPLC

YANG Qing-shan1，2，CAI Rong-hua1，XU Meng2，WANG Lei1，2，GAO Wei1，2，*
（1.Chenguang Biotech Group Co.，Ltd.，Handan 057250，Hebei，China；2.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments，Handan 057250，Hebei，China）

Abstract：A Ultra Performance Liquid Chromatographic method was developed for the determination of chlorogenic acid and caffeine in coffee beans.Coffee bean sample was smashed and ultraphonic extracted with methanol-water（70∶30，by volumn）.The separation of chlorogenic acid and caffeine were achieved with a Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column by using a mixture of acidic property acetonitrile-water as the mobile phase.The ultraviolet detector was set at 274 nm.The chlorogenic acid and caffeine in coffee bean was extracted completely.There was a good linear relationship between chromatographic peak areas and the concentrations of chlorogenic acid in the range of 88.4 mg/L-442 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 3. The RSDs of the method were in the range of 2.81%，and the average recoveries were between 98.24%and 99.72%.There was also a good linear relationship between chromatographic peak areas and the concentrations of caffeine in the range of 28.8 mg/L-143 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 8.The RSDs of the method were in the range of 1.34%，and the average recoveries were between 98.50%and 101.32%.The results showed that the method was successfully applied in the analysis of chlorogenic acid and caffeine in coffee bean with its good repeatability and sensitivity.

Key words：coffee bean；chlorogenic acid；caffeine；UPLC