響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取甜菜紅色素及其穩(wěn)定性研究

劉英麗，李福芳，張慧娟，王　靜，邸斯婕（北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京100048）

分離提取

響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取甜菜紅色素及其穩(wěn)定性研究

劉英麗，李福芳，張慧娟，王靜*，邸斯婕
（北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京100048）

摘要：通過單因素試驗(yàn)對甜菜紅色素提取條件（料液比、溫度、提取時(shí)間、提取液pH、提取溶劑等）進(jìn)行初步探究，并通過微波輔助對色素提取進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，結(jié)果表明影響提取最顯著的因素是微波時(shí)間，其次是微波功率，最后是料液比。最適提取條件：料液比1∶5.76（g/mL），微波功率398 W，微波時(shí)間112.8 s，此條件甜菜紅色素最大吸光度值為0.711 4。對提取的甜菜紅色素進(jìn)行超濾處理并對其粗提液進(jìn)行穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明光照、pH對其穩(wěn)定性影響顯著，添加不同穩(wěn)定劑對甜菜紅色素穩(wěn)定性有一定改善，苯甲酸鈉（0.04%）和VC（0.04%）復(fù)配使用對于提高其穩(wěn)定性作用較為明顯。

關(guān)鍵詞：甜菜；色素；微波輔助提取；響應(yīng)面優(yōu)化法；穩(wěn)定性

甜菜是我國北方的一個(gè)主要糖來源，種植較多。其根部含有極為豐富的紅色素，主要的色素成分是甜菜紅（Betalains），占色素總量的70%～90%，包括紅色的甜菜紅素（Betacyanins） 及黃色的甜菜黃素（Betaxanthins），是很好的色素來源[1]。西歐每年大約產(chǎn)出20萬t以上的甜菜根，其中大約有10%加工做為色素用途[2]。由于天然植物色素色澤鮮亮，食用安全，具天然抗氧化、抗衰老等特點(diǎn)在食品工業(yè)領(lǐng)域的果汁、冰激凌、點(diǎn)心、罐頭、糖果、酸奶等產(chǎn)品中得到了廣泛的應(yīng)用[3-4]。關(guān)于甜菜紅色素的提取研究大多是用傳統(tǒng)的溶劑萃取法，方法簡單但耗時(shí)長，提取率低，用于工業(yè)化生產(chǎn)效率低[5-6]。本研究對微波輔助提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用響應(yīng)面法來優(yōu)化天然物提取工藝，使提取效率與甜菜紅色素的產(chǎn)量得到較大幅度提升。同時(shí)，由于甜菜紅色素的穩(wěn)定性是甜菜作為天然色素在食品中應(yīng)用的最大限制，其穩(wěn)定性的研究也成為一個(gè)亟待解決的問題和著眼點(diǎn)[7-9]，本研究試圖通過加入穩(wěn)定劑，包括防腐劑和抗氧化劑等探索一個(gè)能夠提高甜菜紅色素穩(wěn)定性的方法，為甜菜紅色素的擴(kuò)大應(yīng)用提供一定的借鑒和指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅甜菜：購于吉林農(nóng)安縣；苯甲酸鈉D-異維生素鈉VC檸檬酸均為食品級；實(shí)驗(yàn)室各種常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。

刨絲器：購于超市；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：島津；恒溫水浴鍋：山東華魯電熱儀器有限公司；XH-100A電腦微波催化合成儀/萃取儀：祥鵠科技；超聲設(shè)備、JDX-02型超聲波電源：北京金星超聲波設(shè)備技術(shù)有限公司；MSC超濾杯300 mL裝量、超濾膜截留分子量6000：上海摩速科學(xué)器材有限公司；601型攪拌式電極架：上海三信儀表廠。

1.2方法

1.2.1原料預(yù)處理

新鮮紅甜菜，清洗去皮，刨絲（直徑3 mm～4 mm）待用。

1.2.2提取工藝流程

紅甜菜絲加入一定比例的提取溶劑，靜置攪拌/微波/超聲處理一段時(shí)間后，用紗布濾掉甜菜絲，濾液離心，再用濾紙抽濾，靜置10 min，稀釋（取0.4 mL加入10 mL水），于535 nm處測定吸光度值A(chǔ)。

1.2.3甜菜紅色素提取的單因素試驗(yàn)條件優(yōu)化

1.2.3.1時(shí)間對提取效果的影響

準(zhǔn)確稱量30 g甜菜絲，加入一定量的水溶解，設(shè)置六組實(shí)驗(yàn)，分別放置1、2、3、4、5、6 h，每半個(gè)小時(shí)攪拌一次，每次攪拌5 min，后過濾布過濾、濾紙抽濾，靜置10 min，取上清液稀釋相同倍數(shù)，于535 nm處測定吸光度值A(chǔ)。

1.2.3.2料液比對提取效果影響

準(zhǔn)確稱量30 g甜菜絲，分別加入60、120、150、180、210 mL水溶解，放置4 h，每個(gè)半小時(shí)攪拌一次，每次攪拌5 min，后過濾、離心，取上清液稀25倍，于535 nm處測定吸光度值A(chǔ)。

1.2.3.3溫度對提取效果的影響

準(zhǔn)確稱量30 g甜菜絲，加入一定量水溶解，設(shè)置5組實(shí)驗(yàn)，分別在20、40、50、60、70℃下水浴加熱4 h，后進(jìn)行如上相同的處理，并于535nm處測吸光度值A(chǔ)。

1.2.3.4溶劑對提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取30 g甜菜絲，設(shè)置五組實(shí)驗(yàn)，分別加入相同體積的水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇溶解，提取4 h，后進(jìn)行如上相同的處理，并于535 nm處測其吸光度值A(chǔ)。

1.2.3.5pH對提取效果的影響

用檸檬酸和磷酸氫二鈉配置一系列不同pH的緩沖溶液，用pH分別為3、4、5、6、7、8的緩沖溶液提取甜菜紅色素，其他提取條件如上，并進(jìn)行如上相同處理，于535 nm處測吸光度值A(chǔ)。

1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取甜菜紅色素工藝

根據(jù)Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取料液比、微波功率和微波時(shí)間3個(gè)因素，采用三因素的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化甜菜紅色素提取工藝。Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平編碼，如表1。利用design expert7.0.0進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表1　Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1　Box-Benhnken experimental factor level coding table

1.2.5甜菜紅色素的穩(wěn)定性研究

用外壓式超濾杯截留分子量為6 000 Da的超濾膜對提取液進(jìn)行超濾，目的是為了除去其中的大分子多糖、蛋白質(zhì)等的干擾[10]，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行研究，了解光照，不同pH以及穩(wěn)定劑對甜菜紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.5.1光照對甜菜紅色素穩(wěn)定性的影響

將粗提后的甜菜紅色素溶液，分別取適量至于兩個(gè)錐形瓶內(nèi)，一個(gè)放在陽光充足的地方，另一個(gè)用錫紙進(jìn)行避光處理。每隔1、2、4、6、8、12、16天測一次吸光度值。

1.2.5.2pH對甜菜紅色素穩(wěn)定性的影響

將粗提后的甜菜紅色素溶液的pH分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9，常溫下避光低溫保存，每隔1、2、4、6、8、12天測一次吸光度值。

1.2.5.3穩(wěn)定劑對甜菜紅色素穩(wěn)定性的影響

將粗提后的甜菜紅色素溶液稀釋，分別加入一定比例的穩(wěn)定劑：苯甲酸鈉（0.02%、0.04%）、VC（0.02%、0.04%）、檸檬酸（0.02%、0.04%），D-異維生素鈉（0.02%、0.04%），一周后觀察甜菜紅色素提取液顏色及其品質(zhì)變化，選取比較好的實(shí)驗(yàn)組所含的添加劑進(jìn)行單獨(dú)添加及復(fù)配試驗(yàn)，做時(shí)間-吸光度值變化曲線，每隔1、2、4、6、8、12天測一次吸光度值。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在圖表內(nèi)表現(xiàn)為誤差線的高低，t值進(jìn)行顯著性分析，應(yīng)用Spss軟件進(jìn)行差異性分析。響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素對甜菜紅色素提取率的影響

料液比、時(shí)間、溫度、pH、溶劑等對提取率的影響見圖1～圖5。

圖1　料液比對提取率的影響Fig.1　Impact of extraction liquid ratio on yield

如圖1所示，隨著料液比的增加，提取的甜菜紅色素的濃度增加，加水量為甜菜絲質(zhì)量的2倍到5倍增加時(shí)，提取色素濃度增加明顯，增加到6倍～7倍時(shí)，甜菜紅色素濃度也有一定程度的增加，但增加幅度不大，考慮到加水量越大，濃縮成本越高。因此并非加水量越多越好。綜上所述，加水量為5倍時(shí)，提取效果最佳。

圖2　時(shí)間對提取率的影響Fig.2　Impact of extraction time on yield

如圖2所示，隨著提取時(shí)間的延長，甜菜紅色素濃度呈上升趨勢，超過4 h后，提取的甜菜紅色素濃度變化不大，甚至有略微下降。綜上所述，最佳提取時(shí)間為4 h。

圖3　溫度對提取率的影響Fig.3　Impact of extraction temperature on yield

如圖3所示，甜菜紅色素是一種熱不穩(wěn)定的色素，隨著溫度升高，甜菜紅色素結(jié)構(gòu)遭到破壞，在此過程中對甜菜紅色素影響較大的是多酚氧化酶活性[11-12]。在較低溫度時(shí)，溫度升高，多酚氧化酶活性升高，提取甜菜色素部分被氧化，不利于甜菜紅色素的提取[11，13]。50℃～60℃時(shí)，多酚氧化酶活性最高，超過60℃，多酚氧化酶活性降低。圖3中20℃～50℃甜菜提取率呈下降趨勢，而在60℃有所升高，可能是溫度對多酚氧化酶活性有所抑制，甜菜提取率呈現(xiàn)一定升高趨勢，但溫度繼續(xù)升高，甜菜提取率下降，原因是甜菜紅色素?zé)岱€(wěn)定性較差，溫度升高，破壞了甜菜紅色素的結(jié)構(gòu)。綜上所述，常溫20℃提取，是最經(jīng)濟(jì)也是最有效的提取溫度條件。

圖4　乙醇濃度對提取率的影響Fig.4　Impact of ethanol concentration on yield

圖5　pH對提取率的影響Fig.5　Impact of pH on the yield

如圖4所示，甜菜紅色素是水溶性色素[14]，在水中溶解度較好，用系列濃度的乙醇溶液提取，50%乙醇提取效果略微高于水提取，但從經(jīng)濟(jì)角度來說，選水作為提取溶劑比較合適。

如圖5所示，隨著提取液pH由低到高轉(zhuǎn)變提取的甜菜紅色素濃度呈下降趨勢。在pH為3時(shí)，提取效果達(dá)到最佳。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取工藝

根據(jù)表1，設(shè)計(jì)微波輔助提取甜菜紅色素的響應(yīng)面試驗(yàn)，測定稀釋相同倍數(shù)的提取液讀取吸光度值A(chǔ)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　微波輔助提取甜菜紅色素的響應(yīng)面數(shù)據(jù)Table 2　Microwave assisted extraction of red beet pigment response surface data

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案及結(jié)果分析見表3。

表3　回歸模型的方差及顯著性分析Table 3　Regression model of variance and significant analysis

利用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立關(guān)于甜菜提取甜菜紅色素產(chǎn)量的響應(yīng)模型，尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平。得到響應(yīng)值R1（吸光度值）和各因子（料液比A，微波功率B，微波時(shí)間C）之間的回歸擬合方程：

R1=+0.711 40+0.002 625 00A-0.007 625 00B-0.029 000C+0.013750AB+0.023 000AC-0.00550000BC-0.024 825A2-0.025 325B2-0.042 075C2

從表3可以看出，回歸模型的F值為36.61，“Pr＞F”<0.05，說明所得的回歸方程擬合的較好，回歸效果顯著，而失擬項(xiàng)F=2.17、P=0.234 8＞0.05，差異不顯著，因此用此回歸方程模型來模擬3個(gè)因素與指標(biāo)值的關(guān)系是可行的。在這個(gè)模型中B、C、AB、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，說明因素影響顯著。

三因素影響顯著性相比，影響最顯著的因素是微波時(shí)間，其次是微波功率，最后是料液比。

將料液比、微波功率、微波時(shí)間3個(gè)參數(shù)分別固定，吸光度值隨其余兩個(gè)參數(shù)變化趨勢如圖6～圖8。

圖6　微波功率和微波時(shí)間對提取率的影響Fig.6　Impact of microwave power and time on yield

圖7　料液比和微波時(shí)間對提取率的影響Fig.7　Impact of liquid ratio and microwave time on yield

從圖6～圖8可以形象的看出各因素及其交互作用吸光度值的影響。圖6為微波功率和微波時(shí)間對甜菜提取液濃度的影響，可以看出，甜菜提取液濃度隨著微波功率的增加先上升后下降，隨著微波時(shí)間的增加亦有先升高后下降的趨勢。從圖7為料液比和微波時(shí)間對甜菜提取液的影響，結(jié)果表明，料液比和微波時(shí)間對甜菜提取液濃度都有顯著影響，均是先升高后下降的趨勢。圖8料液比和微波功率對甜菜提取液濃度的影響中可以看出，料液比和微波功率對甜菜提取液濃度影響顯著，亦均是先升高后下降的趨勢。

通過Design-Expert軟件對試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化得到的最適提取條件：料液比1∶5.76（g/mL），微波功率398 W，微波時(shí)間112.8 s，最大吸光度值為0.711 4。此條件下模型擬合系數(shù)較高，差異顯著。

2.3甜菜紅色素的穩(wěn)定性研究

2.3.1光照、pH對甜菜紅色素穩(wěn)定性的影響

光照處理后的甜菜紅色素溶液和經(jīng)錫紙避光處理的甜菜紅色素溶液，其吸光度值的變化見圖9；將甜菜紅色素溶液調(diào)制不同pH下的色素保留量差異如圖10；不同pH條件下，甜菜紅色素溶液濃度隨時(shí)間變化如圖11。

圖8　料液比和微波功率對提取率的影響Fig.8　Impact of liquid ratio and microwave power on yield

圖9　光照對甜菜紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.9　Impact of sunshine on stability of pigment

由圖9可以看出，經(jīng)避光處理的甜菜紅色素溶液比在光照下放置的甜菜紅色素溶液的吸光度值變化小，說明光照會影響甜菜紅色素溶液穩(wěn)定性，使其明顯降低。但經(jīng)避光處理的甜菜紅色素溶液吸光度值也有很明顯的下降，說明光照并不是唯一影響其穩(wěn)定性的因素，溫度、pH等均會影響其穩(wěn)定性。

將甜菜紅色素提取液調(diào)至不同的pH，其吸光度值變化如圖10，pH在4～6時(shí)，甜菜紅色素穩(wěn)定存在。這與甜菜紅色素對pH的穩(wěn)定性有關(guān)，當(dāng)pH<4時(shí)，甜菜紅色素由紅色向紫色轉(zhuǎn)變；pH＞7時(shí)，甜菜紅色素也是向紫色轉(zhuǎn)變。當(dāng)pH＞10時(shí)，甜菜紅堿會轉(zhuǎn)變?yōu)樘鸩它S堿，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色[15]。不同pH條件下，甜菜紅色素提取液的濃度隨時(shí)間的變化如圖11，甜菜紅色素提取液在pH=4～6時(shí)，相對比較穩(wěn)定。

2.3.2穩(wěn)定劑對甜菜紅色素溶液穩(wěn)定性的影響

將粗提后的甜菜紅色素溶液稀釋，分別加入一定比例的穩(wěn)定劑：苯甲酸鈉（0.02%、0.04%）、VC（0.02%、0.04%）、檸檬酸（0.02%、0.04%），D-異維生素鈉（0.02%、0.04%）。7天后觀察其色素溶液顏色變化，結(jié)果見表4。

圖1　0　不同pH條件下甜菜紅色素保留量Fig.10　Impact of pH on retention

圖1　1　不同pH條件下甜菜紅色素穩(wěn)定性Fig.11　Impact of pH on stability of pigment

表4　不同種類、濃度的穩(wěn)定劑對甜菜紅色素穩(wěn)定性的影響Table 4　Impact of various kinds and concentration of stabilizer on the stability of the pigment

由表4可以看出，苯甲酸鈉（0.04%）和VC（0.04%）對于提高甜菜紅色素穩(wěn)定性效果較為顯著，可用于甜菜紅色素提取液的穩(wěn)定性研究。苯甲酸鈉（0.04%）和VC（0.04%）單獨(dú)添加及復(fù)配使用對甜菜紅色素溶液穩(wěn)定性的影響如圖12。

圖1　2　苯甲酸鈉、VC及其復(fù)配使用對甜菜紅色素溶液穩(wěn)定性的影響Fig.12　Impact of sodium benzoate，VCand both two on stability of pigment

結(jié)果表明，苯甲酸鈉和VC對甜菜紅色素的穩(wěn)定性均有顯著提高，其復(fù)配使用效果最佳。

3　結(jié)論

本研究首先通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了合適提取甜菜紅色素的條件為：最適料液比1∶5（g/mL），溫度20℃，提取時(shí)間4 h，提取液pH=3，綜合高效經(jīng)濟(jì)等因素提取溶劑選取水作提取溶劑。借助微波輔助提取條件的優(yōu)化，對微波輔助提取色素做響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并對其顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果表明對提取率影響大小為：微波時(shí)間＞微波功率＞料液比。最終得到其最適提取條件：料液比1∶5.76（g/mL），微波功率398 W，微波時(shí)間112.8 s，最大吸光度值為0.711 4。此條件模型擬合系數(shù)較高，差異顯著。用超濾杯對提取的甜菜紅色素進(jìn)行粗提并進(jìn)行穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明光照、pH對其穩(wěn)定性影響顯著。添加不同穩(wěn)定劑對甜菜紅色素穩(wěn)定性有一定改善，苯甲酸鈉（0.04%）和VC（0.04%）復(fù)配使用對于提高穩(wěn)定性作用較明顯。

通過本研究的探索可以得出甜菜紅色素的最佳提取工藝，獲得產(chǎn)率較高，同時(shí)通過不同穩(wěn)定劑的研究，對于擴(kuò)大甜菜紅色素在食品領(lǐng)域的應(yīng)用有重要的意義，但是這種穩(wěn)定性的提高具一定的局限性，甜菜紅色素當(dāng)前只是較適用于飲料、冰激凌等食品中，對于需要高溫加熱的食品如添加到肉制品進(jìn)行護(hù)色等方面還不盡人意，有待于進(jìn)一步研究和開發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

[1]郝秀梅.甜菜紅色素的分離純化及抗氧化與抗疲勞活性的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2011

[2]郝秀梅,王振宇,任健,等.紅甜菜水提物及其色素體外抗氧化性能的研究[J].食品工業(yè)科技,2011(5):162-164,167

[3]Azeredo H.Betalains:properties,sources,applications,and stability-a review[J].International journal of food science&technology, 2009,44(12):2365-2376

[4]高彥祥,劉璇.甜菜紅色素研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑,2006(1): 65-70

[5]王宏茲,李進(jìn)偉,范柳萍.超聲-微波協(xié)同萃取法提取紫薯色素[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(33):18664-18666

[6]王振宇,郝秀梅.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取紅甜菜色素的工藝[J].中國調(diào)味品,2011(1):85-89

[7]李偉.紅葉甜菜紅色素的穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué),2009(13): 105-107

[8]張琳,祖元?jiǎng)?王春麗,等.食品添加劑對紅甜菜色素穩(wěn)定性的影響[J].食品工業(yè)科技,2011(7):346-348

[9]熊勇.甜菜紅色素的制備及其穩(wěn)定性的研究[D].南昌:南昌大學(xué), 2011

[10]Chethana S,Nayak C A,Raghavarao K.Aqueous two phase extraction for purification and concentration of betalains[J].Journal of food engineering,2007,81(4):679-687

[11]王成.甜菜紅色素的提取工藝及其理化性質(zhì)研究[D].南京工業(yè)大學(xué),2003

[12]李偉,周大寨.浸提溶劑對紅葉甜菜紅色素的影響[J].食品科學(xué), 2012(17):87-89

[13]Azeredo H.Betalains:properties,sources,applications,and stability-a review[J].International journal of food science&technology, 2009,44(12):2365-2376

[14]李偉,周大寨.浸提溶劑對紅葉甜菜紅色素的影響[J].食品科學(xué), 2012(17):87-89

[15]Azeredo H.Betalains:properties,sources,applications,and stability-a review[J].International journal of food science&technology, 2009,44(12):2365-2376

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.012

收稿日期：2014-06-17

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271976）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B05）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（CIT&TCD20130309，IDHT20130506）

作者簡介：劉英麗（1981—），女（漢），講師，博士，主要從事食品品質(zhì)改良方面的研究。

*通信作者

Response Surface Methodology for Optimizing Microwave Assisted Extraction of Betalain from Beet and Its Stability Studies

LIU Ying-li，LI Fu-fang，ZHANG Hui-juan，WANG Jing*，DI Si-jie
（Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Abstract：The appropriate extraction conditions of betalain from beets by single factor experiment（solvent ratio，temperature，extraction time，pH，extraction solvent）were determined.On the basis of that conclusion，using response surface methodology（RSM）for optimizing extraction of betalain investigated the effects of solvent/material ratio，microwave output power and micro-wave time.The results showed that among the three factors the microwave time most significantly affected on the absorbance，followed by the microwave output power and the solvent/material ratio.The optimal conditionswere asfollows：solvent/material ratio 1∶5.76（g/mL），microwave output power 398 W and microwave time 112.8 s，the highest absorbance was 0.711 4.Through ultrafiltration and the stability was studied，research found that the sunshine and pH had significant impact on the stability.Different stabilizers have a certain improvement on the stability of betalain，and using of sodium benzoate（0.04%）and VC（0.04%）together can improve its stability significantly.

Key words：beet；pigment；microwave assisted extraction；response surface methodology（RSM）；stability