大孔吸附樹脂分離提純冬蟲夏草多糖的研究

畢元才（吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林四平136001）

大孔吸附樹脂分離提純冬蟲夏草多糖的研究

畢元才
（吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林四平136001）

摘要：進(jìn)行AB-8和D-280大孔吸附樹脂分離提純冬蟲夏草多糖的研究，確定AB-8大孔吸附樹脂處理冬蟲夏草浸出液時的吸附特性，洗脫液用D-280大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色處理。研究結(jié)果表明：當(dāng)用AB-8大孔吸附樹脂處理濃度為2.0 mg/mL的冬蟲夏草原液200 mL，上樣液的pH為6，多糖滲濾液的流速為0.8 mL/min，得多糖246.4 mg，再經(jīng)D-280大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色處理，最后得到冬蟲夏草多糖207.1 mg。

關(guān)鍵詞：大孔吸附樹脂；冬蟲夏草；多糖；分離提純

冬蟲夏草，又稱冬蟲草、蟲草，它是麥角菌科真菌冬蟲夏草，寄生在幼蟲蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，其主要的藥用機(jī)理為調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，在保護(hù)胃臟功能等方面有著重要的作用[1]。大孔吸附樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物，大孔吸附樹脂的孔徑與比表面積都比較大，AB-8樹脂是一種球形的弱極性聚合物吸附劑，該樹脂對多糖有特殊的選擇性，適合從水溶液中提取多糖物質(zhì)。吸附樹脂?？赏ㄟ^再生反復(fù)使用。D-280樹脂是一種大孔強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂。該樹脂不僅具有適宜的孔徑和比表面而且在其交聯(lián)聚苯乙烯骨架中含有獨(dú)特的季氨基，利用具有此種結(jié)構(gòu)和功能基的樹脂相以及乙醇介質(zhì)對多糖和色素分子作用力的不同，使樹脂對色素分子有較大的選擇性和脫色溶量，從而達(dá)到樹脂對色素和多糖的分離[2]。本試驗(yàn)主要研究了AB-8型大孔吸附樹脂對冬蟲夏草多糖的吸附特性中的原液濃度、上樣液pH和多糖液流速對多糖提取量的影響，并用D-280型大孔吸附樹脂對樣品液進(jìn)行脫色處理，制備出高純度的冬蟲夏草多糖。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑

AB-8型大孔吸附樹脂、D-280型大孔吸附樹脂：購于安徽三星樹脂科技有限公司；乙醇、鹽酸、檸檬酸均為分析純；含氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/kg～15 g/kg的乙醇溶液。

1.1.2主要儀器

分721型光光度計：上海分析儀器廠；NFA-02型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海玻璃儀器二廠；ZK-82B型真空干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；玻璃層析柱（直徑2.0 cm，長度30 cm）：北京頗賽科技發(fā)展有限公司；THZ-82型恒溫箱：廣東宏展科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樹脂預(yù)處理及裝柱

用蒸餾水充分淋洗大孔吸附樹脂，用含氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/kg～15 g/kg的乙醇溶液浸泡2 h～3 h，去掉樹脂表面和孔道內(nèi)殘留的溶劑和活性樹脂，用去離子水洗至中性，無醇味，采用濕法裝柱，將樹脂慢慢裝入直徑2 cm的玻璃柱中，樹脂高約23 cm[3]。

1.2.2多糖的提取工藝

提取冬蟲夏草多糖的工藝流程[4]：冬蟲夏草→粉碎→80%乙醇，45℃水浴回流脫脂2次→殘?jiān)栏伞铀芙?、浸提→過濾→合并濾液→濃縮→調(diào)節(jié)酒精度80%→沉淀多糖→無水乙醇洗滌→丙酮洗滌→乙醚洗滌→加水溶解→粗糖液→上AB-8樹脂柱→反復(fù)洗脫→收集洗脫液→D-280大孔樹脂脫色→45℃真空濃縮→冬蟲夏草多糖。

1.2.3多糖含量的測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用苯酚-硫酸法[5]測定多糖含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖15 mg于50 mL容量瓶中，制備濃度為0.3 mg/mL葡萄糖溶液。準(zhǔn)確量取葡萄糖溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于 10 mL容量瓶中，用去離子水定容。再各取1 mL上述試液于10 mL試管中，分別加入5%苯酚1 mL，混勻后，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻。沸水浴中反應(yīng)15 min，取出后冷卻，用空白管調(diào)至0，在490 nm處進(jìn)行吸光度測定，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

1.2.4AB-8樹脂靜態(tài)吸附容量的確定

將100 mL處理好的AB-8樹脂濕法裝柱，稱取5 g的冬蟲夏草多糖，蒸餾水溶解，過濾，將濾液通過樹脂柱，流出液反復(fù)上柱4次～5次，直至樣品被充分吸附為止，收集流出液。測定流出液多糖含量，按下式計算吸附率[6]

式中：C1為吸附前的多糖濃度，mg/mL；C2為吸附后的多糖濃度，mg/mL；E為吸附率，%。

1.2.5冬蟲夏草多糖液濃度對吸附的影響

按1.2.2方法，配置成1、1.5、2、2.5、3 mg/mL的多糖溶液，進(jìn)行吸附試驗(yàn)，考察不同糖液濃度對AB-8大孔吸附樹脂效果的影響。

1.2.6冬蟲夏草多糖液流速對吸附的影響

為了比較冬蟲夏草多糖液不同流速對吸附的影響，量取一定濃度滲濾液200 mL，以不同流速通過裝有100 mL的AB-8樹脂層析柱中。

1.2.7冬蟲夏草多糖液上樣液pH的確定

將200 mL一定濃度的冬蟲夏草多糖滲濾液用HCl和NaCl調(diào)不同pH，以一定的流速通過裝有100mL AB-8樹脂層析柱中，考察AB-8大孔吸附樹脂對不同pH的多糖液的吸附量影響。

1.2.8D-280樹脂脫色處理

將AB-8大孔吸附樹脂處理后的多糖液通過D-280樹脂，進(jìn)行脫色處理，得到高純度的冬蟲夏草多糖。

2　結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

由實(shí)驗(yàn)方法1.2.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1　冬蟲夏草多糖含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve line of Cordyceps sinensis polysaccharide content determination

如圖1可見，冬蟲夏草多糖濃度（C）與吸光度差值（ΔA）成線性關(guān)系，其線性回歸方程為：ΔA=6.261 5 C-0.005 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，說明冬蟲夏草多糖濃度與吸光度差值線性顯著相關(guān)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

2.2AB-8樹脂靜態(tài)吸附容量的確定

根據(jù)試驗(yàn)方法1.2.4，將制得冬蟲夏草多糖滲濾液以1.0 mL/min的流速進(jìn)入樹脂柱中，將樹脂柱用95%乙醇加入1%鹽酸溶液洗至無色，將洗脫液減壓蒸餾至粘稠狀，再置真空干燥箱內(nèi)30℃以下干燥得1 mL AB-8型大孔吸附樹脂中約2.52 mg的多糖固體。

2.3冬蟲夏草多糖液濃度對吸附的影響

按1.2.5方法，考察不同糖液濃度對AB-8大孔吸附樹脂效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，原液濃度是影響樹脂吸附性能的重要因素之一，濾液的初試濃度在1.8 mg/mL～2 mg/mL較為合適。原液濃度偏低，耗時增加，影響工作效率。原液濃度偏高，則處理量小，泄露早，試驗(yàn)周期短，會造成樹脂的再生次數(shù)增多。

2.4冬蟲夏草多糖液流速對吸附的影響

按照1.2.6方法，分別選擇流速為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min進(jìn)行考察。結(jié)果見圖3。

圖2　原液濃度對冬蟲夏草多糖液吸附的影響Fig.2　The effect of dope concentration on the adsorption of Cordyceps sinensis polysaccharide solution

圖3　冬蟲夏草多糖液流速對吸附率的影響Fig.3　The effects of flow velocity of Cordyceps sinensis polysaccharide solution on the absorption rate

圖3表明，假如吸附操作到達(dá)穿透點(diǎn)后（流出液的目的產(chǎn)物的質(zhì)量濃度達(dá)到進(jìn)液質(zhì)量濃度的5%時，即為吸附終點(diǎn)，達(dá)到吸附終點(diǎn)時流出液體體積定義為穿透點(diǎn)），繼續(xù)進(jìn)料時，由于出口溶質(zhì)濃度急劇增大，造成目標(biāo)產(chǎn)物的損失，因此在實(shí)際操作中，需要在穿透點(diǎn)處停止操作，習(xí)慣上將出口濃度達(dá)到入口濃度的5%～10%時定為穿透點(diǎn)，本試驗(yàn)采用5%時為穿透點(diǎn)。由圖3可見，隨著流速的降低，樹脂的吸附量增加，這是因?yàn)殡S著流速的降低，固液接觸的時間增加，樹脂與料液接觸充分，所以隨著流速的降低樹脂的吸附量增加。當(dāng)流速為0.5、1.0 mL/min時，樹脂的吸附量相差不大，但流速過低，導(dǎo)致操作時間延長，生產(chǎn)周期短，降低樹脂的生產(chǎn)能力，因此可選用糖液流速為1.0 mL/min。

2.5冬蟲夏草多糖液上樣液pH的確定

按照1.2.7方法，冬蟲夏草多糖滲濾液調(diào)pH 3、4、5、6、7、8，考察不同pH對樹脂吸附量的影響，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，上樣液的pH對化合物的吸附和分離有一定的影響。在吸附的過程中物質(zhì)一般以分子狀態(tài)被吸附劑吸附。結(jié)果顯示，當(dāng)上樣液為原液即弱酸性時，洗脫的多糖的純度和含量都最大，可能冬蟲夏草的多糖類物質(zhì)大多呈弱酸性，在弱酸性狀態(tài)下呈分子狀態(tài)被吸附劑吸附，偏酸或偏堿會使物質(zhì)呈游離狀態(tài)，不利于吸附，可能在上樣的時候泄露出來。從而我們可以定義為當(dāng)吸附率達(dá)到60%以上時，可認(rèn)為上樣液的pH為最佳適宜值，即上樣液的最佳pH的范圍為4～6。

圖4　樣品液pH對樹脂吸附率的影響Fig.4　The effects of sample solution pH on the absorption rate of resin

2.6正交試驗(yàn)

2.6.1試驗(yàn)設(shè)計

采用AB-8型大孔吸附樹脂對冬蟲夏草多糖的提取液進(jìn)行分離純化，確定上柱樹脂體積100 mL，在溫度15℃對樹脂分離純化過程中的主要因素如滲濾液原液的濃度、上樣液pH、多糖滲濾液的流速等進(jìn)行考察，選用L9（34）正交表，因素水平設(shè)計如表1。

表1　大孔吸附樹脂吸附影響因素正交設(shè)計Table 1　The orthogonal design of adsorption factors on macroporous adsorption resin

2.6.2試驗(yàn)結(jié)果

以冬蟲夏草多糖達(dá)到穿透點(diǎn)時，樹脂柱對冬蟲夏草多糖的吸附總量作為測評指標(biāo)，確定最佳的吸附條件。按照正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

以冬蟲夏草的多糖的吸附率為考察指標(biāo)進(jìn)行極差分析可見各因素影響吸附量程度大小為B>C>A，其中上樣液的pH對吸附量有顯著的影響，A3B3C2為各因素的最佳水平，即當(dāng)滲濾原液的濃度為2.0 mg/mL，上樣液的pH為6，多糖滲濾液的流速為0.8 mL/min為最佳的上柱吸附條件。

2.7D-280吸附樹脂脫色處理

將濃度為2.0 mg/mL的冬蟲夏草原液200 mL經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂處理后的多糖，溶于70%的乙醇溶液中，以0.8 mL/min流速通過D-280樹脂柱，收集流出液，減壓蒸餾濃縮，干燥至恒重，稱量最終所得冬蟲夏草多糖重量為207.1 mg。

表2　正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 2　The orthogonal test and results

3　結(jié)論

用大孔吸附樹脂分離提純冬蟲夏草多糖的最佳工藝條件為：當(dāng)用AB-8大孔吸附樹脂處理200 mL濃度為2.0 mg/mL的冬蟲夏草原液，上樣液的pH為6，多糖滲濾液的流速為0.8 mL/min，得多糖246.4 mg，再經(jīng)D-280大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色處理，最后得到冬蟲夏草多糖207.1 mg。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.016

收稿日期：2014-07-09

作者簡介：畢元才（1963—），男（漢），副教授，碩士，主要從事食品加工方面的研究。

Research on the Separation and Purification of Cordyceps sinensis Polysaccharide by Macroporous Adsorption Resin

BI Yuan-cai
（Jilin Agriculture Engineering Polytechnic College，Siping 136001，Jilin，Chin）

Abstract：The separation and purification of Cordyceps sinensis polysaccharide by AB-8 and D-280 macroporous adsorption resin were researched，confirmed the adsorption characteristics when used AB-8 macroporous adsorption resin to deal with Cordyceps sinensis leachate，and the eluent was decolored and processed by D-280 macroporous adsorption resin.The results showed that when used AB-8 macroporous adsorption resin to deal with 200 mL concentration of 2.0 mg/mL of Cordyceps sinensis liquid，the pH of sample solution was 6，the flow velocity of polysaccharide leachate was 0.8mL/min，got 246.4 mg polysaccharide，which was decolored and processed by D-280 macroporous adsorption resin，finally got 207.1 mg Cordyceps sinensis polysaccharide.

Key words：macroporous adsorption resin；Cordyceps sinensis；polysaccharide；separation and purifaction