基于譜效關(guān)系的α-糖苷酶抑制劑篩選方法研究

王利強，常春艷，婁婷婷，葛含光，王永芳，葛寶坤（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

基于譜效關(guān)系的α-糖苷酶抑制劑篩選方法研究

王利強，常春艷，婁婷婷，葛含光，王永芳，葛寶坤
（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

摘要：采用以生物活性色譜為基礎(chǔ)的譜效篩選模式，以減肥茶為研究對象，首先確認(rèn)了該減肥茶對α-糖苷酶有較強的抑制活性；進(jìn)一步建立了α-糖苷酶抑制劑篩選模型，并與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，對減肥茶進(jìn)行譜效關(guān)系分析，從中篩選到7個對α-糖苷酶有較強的抑制活性的化合物，通過質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。這7個化合物分別為兒茶素、兒茶素沒食子酸脂、蘆丁、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、槲皮素、荷葉堿和大黃素；最后對這7個化合物進(jìn)行活性驗證。建立的基于譜效關(guān)系分析對α-糖苷酶抑制劑的篩選和鑒定的方法簡單、快速、準(zhǔn)確率高。可用于對天然產(chǎn)物等復(fù)雜體系中活性物質(zhì)的快速篩選和鑒定。

關(guān)鍵詞：譜效關(guān)系；篩選體系；α-糖苷酶抑制劑；減肥茶

天然產(chǎn)物資源具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用價值，許多天然產(chǎn)物中含有活性功能的化合物。對天然產(chǎn)物活性成分的研究也是功能食品研究的重點[1-2]。而針對成分復(fù)雜的天然產(chǎn)物，建立一種快速高效的篩選和鑒定體系是提高天然產(chǎn)物研究效率的關(guān)鍵問題。譜效關(guān)系研究是近年來興起的將指紋圖譜與藥效研究相結(jié)合的一種研究方法，常用于天然產(chǎn)物中活性成分靶向性篩選[3]。生物活性色譜技術(shù)是研究譜效關(guān)系重要方法，生物活性色譜將天然產(chǎn)物的成分分離、鑒定和藥效活性評價等步驟在一個體系中完成。相對于傳統(tǒng)方法，生物活性色譜可以極大提高活性物質(zhì)篩選的速度和效率，降低傳統(tǒng)天然產(chǎn)物活性成分開發(fā)的成本[4-5]。

α-糖苷酶是人體內(nèi)將淀粉逐級水解和消化，最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖為人體提供能量的關(guān)鍵酶。研究表明，抑制α-糖苷酶的活性，降低淀粉的消化吸收速率是一種有效的控制體重和減肥的手段之一[6]。因此，以α-糖苷酶為作用靶點，篩選有效的α-糖苷酶抑制劑也成為減肥藥物研發(fā)的重要方向之一[7]。天然產(chǎn)物種類繁多，資源豐富，經(jīng)過幾千年的時間和發(fā)展，也驗證了一些有良好療效的產(chǎn)物，在治療肥胖癥和減肥方面有很大的優(yōu)勢，如荷葉、蓮子、桑枝、黃連、大黃等[8-10]。市售某品牌減肥茶由荷葉、決明子、烏龍茶、澤瀉、苦丁茶、大黃、陳皮等七味中藥為主要原料制成保健食品。經(jīng)試驗證明，具有減肥功能，受到市場的認(rèn)可。但是該配方成分復(fù)雜，目前對其中的活性成分的研究并不全面，僅以槲皮素作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。因此，需要全面對該產(chǎn)品中的活性成分進(jìn)行分析和評價，可以更有效地進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制和藥理研究。

本研究采用以生物活性色譜為基礎(chǔ)的譜效篩選模式，以該減肥茶為研究對象，首先從整體水平評價其對α-糖苷酶的抑制活性，進(jìn)一步采用基于活性的液質(zhì)聯(lián)用篩選模型進(jìn)行譜效關(guān)系分析，并鑒定其中有α-糖苷酶抑制活性的成分，最后對篩選到的活性成分進(jìn)行活性驗證。

1　試驗部分

1.1試劑與儀器

市售某品牌減肥茶：中國；阿卡波糖：美國Sigma公司；人源α-糖苷酶：南開大學(xué)藥學(xué)院提供；葡萄糖測定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司；甲醇、乙腈：美國Thermo-Fisher公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Q-Exactive質(zhì)譜儀：美國Thermo-Fisher公司；Model 680酶標(biāo)儀：美國，Bio-Rad；十萬分之一電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；高速離心機：德國Sigma公司；KQ3200型超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1樣品制備

稱取1.0 g減肥茶于試管中，加入10 mL100℃熱水浸泡30 min，后經(jīng)高速離心機8000 r/min離心10 min，取上清液待用。

1.2.2整體α-糖苷酶抑制活性評價

減肥茶對α-糖苷酶的抑制活性是通過對α-糖苷酶與底物麥芽糖的反應(yīng)速度的影響來測定。在96孔板中加入10 μL 10倍系列稀釋的樣品溶液或者陽性藥，加入100 μL 0.1%的麥芽糖溶液作為底物，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育5 min后，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液啟動反應(yīng)，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，加入20 μL 1 mol/L的HCl終止反應(yīng)。然后用葡萄糖氧化酶法測定反應(yīng)中產(chǎn)生的葡萄糖的含量。取40 μL上述的反應(yīng)液，向其中加入150 μL的葡萄糖工作液。37℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm條件下測定其吸光度值。通過統(tǒng)計軟件Graphpad Prism 5的非線性回歸方法來計算相應(yīng)樣品的IC50值，即抑制率達(dá)到50%時的抑制劑的濃度。

1.2.3譜效關(guān)系分析

取樣品提取液（0.5 g/mL）用Q-Exactive液相色譜質(zhì)譜儀進(jìn)行活性成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。液相條件：Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；二元梯度洗脫：0～15 min 5%～40%B，15 min～30 min 40%～100%B，30min～35 min100%B。流速為0.3mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。樣品溶液通過以上液相條件進(jìn)行分離，分離后用96深孔板進(jìn)行液相餾分的收集，每30 s收集到一個孔內(nèi)。收集后的餾分在50℃的條件下減壓干燥，剩余的物質(zhì)用100 μL的0.1%的麥芽糖溶液充分溶解，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，加入20 μL 1 mol/L 的HCl終止反應(yīng)。然后用葡萄糖氧化酶法測定反應(yīng)中產(chǎn)生的葡萄糖的含量，方法同1.2.2。之后對活性成分進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）離子源，正離子檢測模式。掃描范圍：m/z 100～1 500；分辨率：70 000；毛細(xì)管電壓為3 kV；二級質(zhì)譜碰撞能20 V。

1.2.4活性成分活性驗證

根據(jù)譜效關(guān)系篩選到的活性物質(zhì)，配制10倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。在96孔板中加入10 μL 10倍系列稀釋的單體物質(zhì)溶液，加入100 μL 0.1%的麥芽糖溶液作為底物，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育5 min后，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液啟動反應(yīng)，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，加入20 μL 1 mol/L的HCl終止反應(yīng)。然后用葡萄糖氧化酶法測定反應(yīng)中產(chǎn)生的葡萄糖的含量。通過統(tǒng)計軟件Graphpad Prism 5的非線性回歸方法來計算相應(yīng)樣品的IC50值。

2　結(jié)果與討論

2.1整體α-糖苷酶抑制活性評價

針對減肥茶進(jìn)行α-糖苷酶抑制劑的篩選，考慮到該減肥茶的日常使用方法是熱水浸泡后引用，因此，為了更加接近實際，選用熱水浸泡方式進(jìn)行提取。目前，市售的α-糖苷酶主要是從酵母、鼠和豬體內(nèi)提取得到，為了使活性評價結(jié)果更為準(zhǔn)確，選取南開大學(xué)藥學(xué)院實驗室成功表達(dá)的人源α-糖苷酶。樣品對α-糖苷酶的抑制曲線見圖1。

由圖1可知，減肥茶溶液對α-糖苷酶抑制的IC50值為15.19 mg/mL，而陽性藥阿卡波糖對α-糖苷酶抑制的IC50值1.112 μg/mL，即15.19 mg/mL的減肥茶提取液就能達(dá)到與阿卡波糖1.112 μg/mL相當(dāng)?shù)囊种菩Ч??？紤]到阿卡波糖對α-糖苷酶有極強的抑制作用，因此該減肥茶提取液對α-糖苷酶有較強的抑制作用，該減肥茶中含有α-糖苷酶抑制劑成分，可以對減肥茶中的活性成分進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和鑒定。

圖1　減肥茶提取物和阿卡波糖對α-糖苷酶的抑制曲線Fig.1　Inhibition curve of the extract of slimming tea and acarbose against α-glucosidase

2.2譜效關(guān)系分析

減肥茶提取溶液經(jīng)液相分離后，通過三通分流器分流，90%洗脫液收集于96孔板中用于α-糖苷酶抑制活性檢測，其余10%進(jìn)入質(zhì)譜用于結(jié)構(gòu)鑒定分析。其正離子模式總離子流圖分別如圖2A所示。按0.5 min/孔收集減肥茶提取溶液的UPLC流出液，共收集60段，測定每份流出液對α-糖苷酶的抑制活性，結(jié)果見圖2B，其中的7段樣品具有顯著的α-糖苷酶的抑制活性，以1、2、3、4、5、6、7表示。通過Q-Exactive質(zhì)譜對以上7段具有顯著性NF-κB抑制活性的物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，其一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜信息見表1。

圖2　減肥茶提取物的總離子流圖和α-糖苷酶抑制活性圖Fig.2　The TIC chromatography of extract of Slimming Tea and bioactivity chromatograms of α-glucosidase inhibition activity

由一級質(zhì)譜（MS）測定可以得到物質(zhì)的精確分子量信息，通過這些物質(zhì)的精確分子量比對相關(guān)的文獻(xiàn)報道及化合物庫，推測各個物質(zhì)的分子式，再根據(jù)二級質(zhì)譜（MS/MS）中的碎片信息（表1），并結(jié)合每個單味藥材中已報道的成分結(jié)構(gòu)信息，推測物質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)式。按照上述方法進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)解析，該減肥茶提取溶液篩選到的7個α-糖苷酶抑制劑分別是兒茶素、兒茶素沒食子酸脂、蘆丁、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、槲皮素、荷葉堿和大黃素。

表1　減肥茶中α-糖苷酶抑制劑的鑒定結(jié)果Table 1　MS/MS data and the identification results for the bioactive compounds in slimming tea

2.3活性成分活性驗證

根據(jù)譜效關(guān)系分析，篩選到了兒茶素、兒茶素沒食子酸脂、蘆丁、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、槲皮素、荷葉堿和大黃素7種可能的α-糖苷酶抑制劑?？紤]到譜效分析中對化合物的活性測定都是在單一濃度條件下進(jìn)行的，可能會有一定的假陽性幾率。因此，進(jìn)一步測定這些化合物對α-糖苷酶的抑制曲線，通過對α-糖苷酶抑制的IC50值對其抑制活性進(jìn)行評價。結(jié)果顯示見圖3。

由圖3可知，槲皮素的IC50為2.40 μg/mL，荷葉堿的IC50為3.43 μg/mL，兒茶素的IC50為4.47 μg/mL，2-羥基-1-甲氧基阿樸啡的IC50為18.85 μg/mL，兒茶素沒食子酸脂的IC50為24.08 μg/mL，大黃素的IC50為37.55 μg/mL，蘆丁的IC50為253.8 μg/mL。表明7種化合物對α-糖苷酶都有一定的抑制作用，槲皮素，荷葉堿和兒茶素對α-糖苷酶的抑制作用與陽性藥物強α-糖苷酶抑制劑阿卡波糖的IC50（1.112 μg/mL）屬于同一水平，也屬于強α-糖苷酶抑制劑，2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、兒茶素沒食子酸脂、大黃素對α-糖苷酶的抑制作用次之，蘆丁的抑制作用較弱。文獻(xiàn)研究表明：槲皮素、荷葉堿、蘆丁和2-羥基-1-甲氧基阿樸啡主要來源于減肥茶中荷葉[11]，兒茶素，兒茶素沒食子酸酯主要來源于烏龍茶，苦丁茶和荷葉[12-13]，大黃素主要來源于決明子和大黃[14-15]。表明這幾味藥材是該減肥茶中α-糖苷酶抑制劑的主要來源，而該減肥茶配方中多數(shù)配料含有α-糖苷酶抑制劑，也說明表明抑制α-糖苷酶的活性，減少淀粉等碳水化合物的代謝也是該減肥茶的一個主要的作用機理。本研究建立的譜效篩選體系對α-糖苷酶抑制劑的篩選和鑒定的方法簡單、快速、準(zhǔn)確率高。本方法可以較好解決以往中藥等復(fù)雜成分中活性成分篩選中需要藥材量大，操作繁瑣的問題。對于難以分離和含量較少的化合物也可實現(xiàn)高效篩選和鑒定。

圖3　7種化合物對α-糖苷酶的抑制曲線Fig.3　Inhibition curve of the extract of seven compounds注：濃度單位為μg/mL。

3　結(jié)論

本研究采用以生物活性色譜為基礎(chǔ)的譜效篩選模式，以市售某品牌減肥茶為研究對象，首先在整體水平上確認(rèn)該減肥茶對α-糖苷酶有較強的抑制活性；進(jìn)一步建立針對微量樣品的α-糖苷酶抑制劑篩選模型，并與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，對該減肥茶進(jìn)行譜效關(guān)系分析，從中篩選到7個對α-糖苷酶有較強的抑制活性的化合物，通過質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，這7種化合物分別為：兒茶素、兒茶素沒食子酸脂、蘆丁、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、槲皮素、荷葉堿和大黃素；最后對這7種化合物進(jìn)行活性驗證。本研究建立的譜效篩選體系對α-糖苷酶抑制劑的篩選和鑒定的方法簡單、快速、準(zhǔn)確率高?？捎糜趯μ烊划a(chǎn)物等復(fù)雜體系中活性物質(zhì)的快速篩選和鑒定。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.008

收稿日期：2015-09-01

基金項目:天津出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（TK078-2013）

作者簡介：王利強（1984—），男（漢），工程師，博士，研究方向：食品檢測。

Study on Screening of the Effective Components for Inhibition α-Glucosidase Based on Chromatography-efficacy Relationship

WANG Li-qiang，CHANG Chun-yan，LOU Ting-ting，GE Han-guang，WANG Yong-fang，GE Bao-kun
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：The chromatography-efficacy relationship screening based bioactive chromatography was used for the research on slimming tea.The inhibition activity of the slimming tea against α-glucosidase was validated firstly.Then the α-glucosidase inhibitor screening method combined with HPLC-MS/MS system was established for the chromatography-efficacy relationship of slimming tea，seven compounds with α-glucosidase inhibition activity were obtained.The compounds structure were characterized as：catechin，catechingallate，rutin，2-hydroxy-1-methoxyaporphine，quercetin，nuciferin and emodin.The α-glucosidase inhibition activity of these compounds were comfirmed.The method for α-glucosidase inhibitor screening and identification based chromatography-efficacy relationship was simple，fast and with high accuracy.It can be used for the bioactivie compounds screening and identification in the complicated natral product.

Key words：chromatography-efficacy relationship；screening system；α-glucosidase；slimming tea