瓜蔞多糖的體內(nèi)免疫活性研究

張岫秀，蔡盈，吳中梅，高勇（.徐州市兒童醫(yī)院，江蘇徐州22006；2.徐州市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，江蘇徐州22006）

瓜蔞多糖的體內(nèi)免疫活性研究

張岫秀1，蔡盈1，吳中梅1，高勇2，*
（1.徐州市兒童醫(yī)院，江蘇徐州221006；2.徐州市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，江蘇徐州221006）

摘要：研究瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠的免疫促進(jìn)作用。通過(guò)腹腔注射環(huán)磷酰胺制備免疫抑制小鼠模型，考察不同劑量瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬能力和淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。瓜蔞多糖可顯著提高免疫抑制小鼠臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬能力和淋巴細(xì)胞增殖能力。瓜蔞多糖具有良好的免疫增強(qiáng)活性，具有較高的研究與開發(fā)價(jià)值。

關(guān)鍵詞：瓜蔞；多糖；免疫增強(qiáng)活性

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓 Trichosanthes kirilowii Maxim.或雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的干燥成熟果實(shí)，據(jù)《中國(guó)藥典》2010版記載，瓜蔞歸肺、胃、大腸經(jīng)，具有清熱滌痰，寬胸散結(jié)，潤(rùn)燥滑腸等功效，在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，范圍廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，瓜蔞果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，干燥的瓜蔞果實(shí)約含粗蛋白19%，碳水化合物41%，脂肪4.8%，含有豐富的有機(jī)酸、生物堿、揮發(fā)油、甙類、黃酮類等化合物[1]。有關(guān)瓜蔞有機(jī)酸、氨基酸、揮發(fā)油、黃酮類化合物的研究已有報(bào)道，而對(duì)瓜蔞多糖的活性研究鮮有報(bào)道，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有較多的生物活性，如增強(qiáng)免疫力、抗氧化、降血糖、抗腫瘤等，利用價(jià)值較高，本研究對(duì)瓜蔞多糖進(jìn)行了提取和純化，并研究了其體內(nèi)免疫活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用瓜蔞資源提供了試驗(yàn)支持。

1　試驗(yàn)材料

1.1試劑

環(huán)磷酰胺（批號(hào)：13110925）：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基：上海浩然生物技術(shù)有限公司；刀豆素A（ConA）：北京中生瑞泰科技有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、Sephadex-G100、Sephadex-G75：北京索萊寶科技有限公司；ADS-5大孔吸附樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；雞紅細(xì)胞：廣州蕊特生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2儀器

RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1B-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；EP2.5 96孔板離心機(jī)：廣州科僑實(shí)驗(yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司；752PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；MK3型酶標(biāo)儀：Thermo Fisher。

1.3材料

瓜蔞：經(jīng)河北省農(nóng)林科學(xué)院藥用植物研究中心謝曉亮主任鑒定為葫蘆科植物栝樓的干燥果實(shí)。

2　試驗(yàn)方法

2.1瓜蔞多糖制備與含量測(cè)定

水提醇沉法制備瓜蔞粗多糖[2]，粗多糖經(jīng)Sevag法脫除蛋白，采用ADS-5大孔吸附樹脂脫除色素，采用Sephadex-G100和Sephadex-G75柱去除其他雜質(zhì)[3-4]。收集洗脫液，真空濃縮，真空冷凍干燥，獲得高純度瓜蔞多糖，采用苯酚-硫酸法[5]測(cè)定瓜蔞多糖含量。

2.2瓜蔞多糖體內(nèi)免疫活性測(cè)定

2.2.1小鼠分組與造模處理

將50只昆明種雄性小鼠（體重17 g～21 g）隨機(jī)平均分成5組，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、瓜蔞多糖低劑量組、瓜蔞多糖中劑量組和瓜蔞多糖高劑量組。各組正常飼養(yǎng)一周后，模型對(duì)照組和瓜蔞多糖低、中、高劑量組小鼠每天腹腔注射CTX 40 mg/kg，灌胃生理鹽水0.3 mL，空白對(duì)照組小鼠每天腹腔注射相同體積的生理鹽水，灌胃生理鹽水0.3 mL。一周后，瓜蔞多糖低、中、高劑量組小鼠分別每天灌胃不同濃度多糖溶液0.3 mL，高、中、低劑量分別為150、100、50 mg/kg，模型組和空白對(duì)照組每天灌胃生理鹽水0.4 mL，連續(xù)灌胃21 d。

2.2.2小鼠臟器指數(shù)測(cè)定[6-7]

末次給藥24 h后，各試驗(yàn)組取5只小鼠，秤取活重，然后將小鼠脫頸椎處死，立即于無(wú)菌條件下摘取胸腺和脾臟，將表面水分吸干，分別于分析天平上稱重，計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。

胸腺指數(shù)/（mg/g）=胸腺重量/小鼠活重

脾臟指數(shù)/（mg/g）=脾臟重量/小鼠活重

2.2.3小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力測(cè)定[8]

小鼠末次給藥后1 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各取5只小鼠，分別向腹腔內(nèi)注射0.5 mL 3%雞紅細(xì)胞，10 h后脫頸椎處死。剪開小鼠腹部皮膚，采用3 mL生理鹽水沖洗腹腔，輕揉，吸取數(shù)滴沖洗液于載玻片上，涂布均勻，然后將載玻片置于濕紗布中，37℃孵育30 min，生理鹽水沖洗，晾干后采用瑞氏染液染色，油鏡鏡檢。每個(gè)載玻片選擇視野較清晰處各計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞，分別計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

吞噬百分率/%＝（吞噬有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/ 200）×100

吞噬指數(shù)＝被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/200

2.2.4小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力測(cè)定[9-11]

取2.2.2所得小鼠脾臟，無(wú)菌研磨，過(guò)200目細(xì)胞篩，制備脾細(xì)胞懸液，采用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液至細(xì)胞個(gè)數(shù)為2.5×106個(gè)/mL，各取400 μL 至96孔培養(yǎng)板中，加入200 mg/L ConA溶液10 μL，培養(yǎng)基代替ConA溶液做對(duì)照，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h各取上清液300 μL，加入MTT溶液（5 mg/mL）60 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束。離心棄上清，各加入37℃DMSO 600 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光值，計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)

脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)/%＝（A處理－A對(duì)照）/A對(duì)照×100

（4）

式中：A處理為加ConA孔吸光值；A對(duì)照為空白孔吸光值。

2.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示數(shù)值，差異顯著性分析采用單因素方差分析。

3　試驗(yàn)結(jié)果

3.1瓜蔞多糖提取結(jié)果

瓜蔞多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.007 1x-0.052 1，R2=0.997，純化后多糖得率為1.14%，多糖含量為92.62%。

3.2瓜蔞多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響見(jiàn)表1。

表1　瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響（x±SD）Table 1　Effect of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on immune organ indexes in immunosuppressive mice（x±SD）

由表1可以看出，模型組小鼠胸腺指數(shù)和臟器指數(shù)較正常組均顯著降低（P<0.01），說(shuō)明免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，中、高劑量組瓜蔞多糖可以極顯著增加胸腺重量（P<0.01），也可以顯著增加脾臟重量（P<0.05，P<0.01），低劑量組臟器指數(shù)增加不明顯。

3.3瓜蔞多糖對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力的影響

瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響見(jiàn)表2。

由表2可以看出，模型組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能較正常組顯著降低（P<0.01），表明免疫抑制模型造模成功。高劑量瓜蔞多糖可顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，與模型組相比，吞噬率顯著提高（P<0.05），吞噬指數(shù)極顯著提高（P<0.01），中劑量瓜蔞多糖也可顯著提高吞噬指數(shù)（P<0.05）。

表2　瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±SD）Table 2　Effect of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on abdominal cavity macrophage function in immunosuppressive mice （±SD）

表2　瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±SD）Table 2　Effect of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on abdominal cavity macrophage function in immunosuppressive mice （±SD）

注：**與正常組比較P<0.01；#與模型組比較P<0.05；##與模型組比較P<0.01；-表示未添加。

組別　劑量/ （mg/kg）　吞噬率/%　吞噬指數(shù)正常組　-　39.571±4.352　0.519±0.067模型組　-　27.603±3.563**　0.352±0.047**瓜蔞多糖低劑量組　50　31.432±3.373　0.402±0.052瓜蔞多糖中劑量組　100　33.614±4.653　0.437±0.051#瓜蔞多糖高劑量組　150　35.522±4.558#　0.472±0.063##

3.4瓜蔞多糖對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增值能力的影響

瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響見(jiàn)表3。

表3　瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響（±SD）Table 3　Effect of of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on lymphocyte proliferation in immunosuppressive mice（x±SD）

表3　瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響（±SD）Table 3　Effect of of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on lymphocyte proliferation in immunosuppressive mice（x±SD）

注：**與正常組比較P<0.01；#與模型組比較P<0.05；-表示未添加。

組別　劑量/（mg/kg）　脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)正常組　-　88.634±9.126模型組　-　63.157±8.273**瓜蔞多糖低劑量組　50　71.328±8.656瓜蔞多糖中劑量組　100　75.457±7.629#瓜蔞多糖高劑量組　150　80.359±8.573#

由表3可以看出，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力較正常組顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，中、高劑量組瓜蔞多糖可以顯著增強(qiáng)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力（P<0.05）。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)腹腔注射環(huán)磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，采用臟器指數(shù)評(píng)價(jià)、巨噬細(xì)胞吞噬能力測(cè)定和淋巴細(xì)胞增殖能力測(cè)定3種方法考察瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫能力的影響。

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫能力的重要方法之一，可反映體內(nèi)淋巴細(xì)胞水平，進(jìn)而反映機(jī)體免疫能力的強(qiáng)弱。本研究發(fā)現(xiàn)瓜蔞多糖可顯著提高免疫抑制小鼠臟器指數(shù)，對(duì)提高小鼠免疫能力具有積極影響。巨噬細(xì)胞吞噬能力可反映機(jī)體非特異性免疫能力水平，參與機(jī)體抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)瓜蔞多糖能顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，表明瓜蔞多糖對(duì)小鼠的非特異性免疫功能具有促進(jìn)作用。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)增殖能力是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，也是反映機(jī)體特異性免疫水平的重要標(biāo)志，本試驗(yàn)中瓜蔞多糖可以提高小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力，可提高小鼠特異性免疫能力。

本研究中瓜蔞多糖對(duì)提高免疫抑制小鼠臟器指數(shù)水平、巨噬細(xì)胞吞噬能力和淋巴細(xì)胞增殖能力均有積極影響，且隨灌胃劑量增加，促進(jìn)作用越明顯，表明瓜蔞多糖對(duì)免疫抑制小鼠特異和非特性免疫功能均有促進(jìn)作用，可提高免疫抑制小鼠的免疫功能水平。綜上，瓜蔞多糖具有良好的免疫增強(qiáng)活性，但其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，因此進(jìn)一步純化瓜蔞多糖、分析其組成，并從細(xì)胞、分子等多層面探討其作用機(jī)制的工作有待于進(jìn)一步展開。此外，多糖應(yīng)用安全性高、范圍廣泛，瓜蔞多糖具有良好的免疫增強(qiáng)活性，應(yīng)用前景廣闊，具有較大的開發(fā)利用價(jià)值。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.004

收稿日期：2015-11-03

基金項(xiàng)目：徐州市衛(wèi)生科技資源現(xiàn)狀調(diào)查與分析（xkqz030）

作者簡(jiǎn)介：張岫秀（1964—），女（漢），副主任護(hù)師，學(xué)士，主要從事兒科護(hù)理與臨床研究。

*通信作者：高勇（1967—），主任技師。

Study on Immunity-enhancing Effect of Polysaccharide from Trichosanthes kiriiowii Maxim

ZHANG Xiu-xiu1，CAI Ying1，WU Zhong-mei1，GAO Yong2，*
（1.Xuzhou Children's Hospital，Xuzhou 221006，Jiangsu，China；2.Xuzhou Institute of Medical Science，Xuzhou 221006，Jiangsu，China）

Abstract：To investigate the immunity-enhancing effect of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on immunosuppressive mice.Mice were injected with CTX to establish the immunosuppressive model.The effects of different doses of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on the index of thymus and spleen，peritoneal macrophage activity and lymphocyte proliferation activity were detected.Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide was effective in improving the immune function of immunosuppressive mice，improved the index of thymus and spleen，increased the phagocytic activity of peritoneal macrophage，proliferation activity of lymphocytes.Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide have better immunity-enhancing effect on immunosuppressive mice，should be further studied for development and application.

Key words：Trichosanthes kiriiowii Maxim；polysaccharide；immunity-enhancing effect