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    L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣水解固形物回用工藝的研究

    2015-07-22 01:22:56耿曉玲王均華江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)紡織工程系江蘇江陰443江陰市食品安全檢測(cè)中心江蘇江陰443
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2015年20期
    關(guān)鍵詞:鳥(niǎo)氨酸正交試驗(yàn)

    耿曉玲,蔡 莉,王均華,王 朋(.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)紡織工程系,江蘇江陰443;.江陰市食品安全檢測(cè)中心,江蘇江陰443)

    L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣水解固形物回用工藝的研究

    耿曉玲1,蔡莉1,王均華2,王朋1
    (1.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)紡織工程系,江蘇江陰214431;2.江陰市食品安全檢測(cè)中心,江蘇江陰214431)

    摘要:以L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣水解固形物為有機(jī)氮源,進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵工藝條件的研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳回用工藝條件為:水解時(shí)間20 h,水解溫度90.0℃,水解液加入量6.5 g/100 mL,6.0 mol/L硫酸溶液(mL)與含水廢菌渣固形物(g)之比1∶2.5。在上述條件下,L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量達(dá)到了37.47 g/L,與酵母膏為有機(jī)氮源進(jìn)行的鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵差異不明顯,且產(chǎn)量穩(wěn)定。

    關(guān)鍵詞:L-鳥(niǎo)氨酸;廢菌渣;正交試驗(yàn);工藝條件

    L-鳥(niǎo)氨酸作為一種醫(yī)藥、保健品以及化工產(chǎn)品的原料應(yīng)用日趨廣泛[1],美國(guó)研究發(fā)現(xiàn)L-鳥(niǎo)氨酸可以用作促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌,以增強(qiáng)肌肉合成和提高基礎(chǔ)代謝及預(yù)防肥胖[2],在歐洲鳥(niǎo)氨酸也作為膳食藥物來(lái)銷(xiāo)售,日本研究者發(fā)現(xiàn)L-鳥(niǎo)氨酸也可以作為食品類(lèi)原料[3-4]。目前在國(guó)際市場(chǎng)上,L-鳥(niǎo)氨酸的絕大部分市場(chǎng)份額被日本占據(jù),國(guó)內(nèi)有少數(shù)幾家生產(chǎn),微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸研究具有重大的經(jīng)濟(jì)意義和理論意義[5]。但是,國(guó)內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)鳥(niǎo)氨酸也面臨著資源浪費(fèi)和環(huán)境污染的嚴(yán)重問(wèn)題[6]。在微生物發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵末期的菌體不是目的產(chǎn)物,因此會(huì)產(chǎn)生大量的廢菌渣固形物,其處理方法是將廢菌渣固形物在污水處理廠中分解或是燃燒處理,這不僅污染環(huán)境、破壞生態(tài),也造成了嚴(yán)重的資源和能源浪費(fèi)[7-10]。本研究擬借鑒國(guó)內(nèi)外的其它發(fā)酵行業(yè)的廢菌渣固形物利用的經(jīng)驗(yàn),開(kāi)發(fā)谷氨酸棒桿菌廢菌絲體的綜合回收利用工藝,以期能顯著減少?gòu)U液的排放量、節(jié)約資源、避免環(huán)境污染,為國(guó)內(nèi)L-鳥(niǎo)氨酸工業(yè)化高效環(huán)保生產(chǎn)奠定基礎(chǔ),對(duì)促進(jìn)國(guó)內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的產(chǎn)業(yè)化和醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展有重要的意義。

    1 材料與設(shè)備

    1.1菌種和廢菌渣固形物

    谷氨酸棒桿菌1006(Corynebacterium glutamicum 1006),用其進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵,發(fā)酵后期收集廢菌渣固形物以備用。

    1.2主要儀器與試劑

    葡萄糖、硫酸銨、七水合硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等均為分析純;酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑。

    Cintra2020紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):澳大利亞GBC公司;安捷倫1100高效液相色譜儀:美國(guó)安捷倫科技公司;AllTech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器:美國(guó)GRACE公司;HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī):湖南赫西儀器有限公司;HYG-Ⅱ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜:上海彥承實(shí)業(yè)有限公司;GZX-9140 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;LRH-250A型生化培養(yǎng)箱:上海儀純有限公司;SBA-40C型生物傳感分析儀:山東省科學(xué)院生物研究所;LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械。

    1.3培養(yǎng)基

    1.3.1保藏培養(yǎng)基

    蛋白胨1.0 g/100 mL,牛肉膏0.5 g/100 mL,NaCl 0.5 g/100 mL,瓊脂2.0,pH 7.00~7.20。

    1.3.2活化培養(yǎng)基

    葡萄糖0.1 g/100 mL,蛋白胨1.0 g/100 mL,牛肉膏0.5 g/100 mL,NaCl 0.5 g/100 mL,瓊脂2.0 g/100 mL,pH 為7.00~7.20。

    1.3.3種子培養(yǎng)基

    葡萄糖2.5 g/100 mL,硫酸銨0.5 g/100 mL,硫酸鎂0.3g/100mL,酵母膏0.5 g/100 mL,碳酸鈣0.4 g/100 mL,少量磷酸鹽和生長(zhǎng)因子,pH為7.60~7.80。滅菌條件:121.0℃,保溫10 min。

    1.3.4發(fā)酵培養(yǎng)基

    1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源

    葡萄糖9.0 g/100 mL,硫酸銨2.5 g/100 mL,硫酸鎂0.4 g/100 mL,酵母膏3.0 g/100 mL,碳酸鈣1.0 g/100 mL,少量的無(wú)機(jī)磷酸鹽和生長(zhǎng)因子,pH為7.60~7.80。滅菌條件:121.0℃保溫10 min。

    1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源

    葡萄糖9.0 g/100 mL,硫酸銨2.5 g/100 mL,硫酸鎂0.4 g/100 mL,廢菌渣固形物水解液6.5 g/100 mL,碳酸鈣1.0 g/100 mL,少量的無(wú)機(jī)磷酸鹽和生長(zhǎng)因子,pH為7.60~7.80。滅菌條件:121.0℃保溫10 min。

    2 方法

    2.1指標(biāo)測(cè)定方法

    2.1.1發(fā)酵液OD值的測(cè)定

    鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液中含碳酸鈣,用一定濃度的HCl溶液溶解碳酸鈣,將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù),在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度OD值。

    2.1.2L-鳥(niǎo)氨酸含量的測(cè)定

    采用HPLC-ELSD法定量測(cè)定L-鳥(niǎo)氨酸的含量。色譜柱為Prevail C18(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm),流動(dòng)相為0.14%三氟乙酸(含0.06%七氟丁酸)溶液-乙腈溶液(88∶22)。在流動(dòng)相流量為0.8 mL/min,氣體流量為2.8 mL/min,ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為110℃,進(jìn)樣量為20 μL的色譜條件下,將不同濃度的L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,以峰面積為橫坐標(biāo),L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽濃度為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程C=1.382 64×10-7A+0.059 37(r=0.999 7)。利用外標(biāo)法,將樣品的峰面積代入回歸方程中,即可求得樣品中L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽的濃度。

    2.1.3殘?zhí)橇康臏y(cè)定

    采用SBA-40C型生物傳感分析儀測(cè)定殘?zhí)恰?.2廢菌渣固形物的水解方法及條件的確定

    本試驗(yàn)采用硫酸水解法進(jìn)行廢菌渣固形物的水解。經(jīng)單因素水解試驗(yàn),選擇合適的酸濃度、廢菌渣固形物的比例及溫度3個(gè)因素,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

    表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test

    2.3廢菌渣固形物水解時(shí)間對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響

    用硫酸溶液直接水解含水廢菌渣固形物,水解時(shí)間不同菌體的水解程度也不同,取一定廢菌渣固形物在一定的水解條件下分別水解不同時(shí)間,然后用于發(fā)酵并檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物量,以確定最佳水解時(shí)間。

    2.4調(diào)廢菌渣固形物水解液pH的方式對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響

    廢酵母水解液新鮮制取時(shí),pH較低,要用較多的堿性物質(zhì)進(jìn)行調(diào)pH。本試驗(yàn)分別采用CaO、NaOH、NH3· H2O對(duì)廢菌渣固形物水解液回調(diào)pH至7.60~7.80。按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方,進(jìn)行發(fā)酵并考察試驗(yàn)結(jié)果。

    2.5添加廢菌渣固形物水解液含量的確定

    在一定的發(fā)酵培養(yǎng)基上依次加不同量的硫酸廢菌渣固形物水解液代替購(gòu)買(mǎi)的硫酸水解的酵母水解液進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),并檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

    2.6連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的分析

    以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行一定批數(shù)搖瓶發(fā)酵,并檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果??疾霯-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵產(chǎn)物量穩(wěn)定性。

    3 結(jié)果與分析

    3.1水解廢菌渣固形物條件的確定

    若是將廢酵母先烘干再進(jìn)行加酸進(jìn)行水解廢酵母,不僅工序繁多,而且造成能源浪費(fèi)。根據(jù)表1中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)廢菌渣固形物直接水解試驗(yàn),結(jié)果如表2。

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 The orthogonal experiment results and analysis

    運(yùn)用極差分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,從表2可以看出,水解廢菌渣固形物最佳條件為:水解溫度為90.0℃,6.0 mol/L硫酸溶液(mL):廢菌渣固形物(g)為1∶2.5。

    3.2廢菌渣固形物水解時(shí)間對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵影響的確定

    通過(guò)正交試驗(yàn)確定了廢菌渣固形物水解的主要條件,本試驗(yàn)中采用硫酸溶液直接水解含水菌體,水解時(shí)間對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵也有一定的影響,在水解溫度為90.0℃,6.0 mol/L硫酸溶液(mL):廢菌渣固形物(g)為1∶2.5的條件下對(duì)濕菌體進(jìn)行水解,在水解時(shí)間為10、15、20、25、30、35 h進(jìn)行取樣,并按1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的配方分別用于發(fā)酵,另外按1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源設(shè)置對(duì)照組,并檢測(cè)發(fā)酵情況,以確定最佳水解時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 水解時(shí)間對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響Table 3 Effects of hydrolysis time on the fermentation of ornithine

    由表3可知,當(dāng)水解時(shí)間超過(guò)20 h,L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量接近對(duì)照組,低于20 h水解的不徹底,L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量不高,隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵影響不大,為了確保水解的充分性,水解時(shí)間安排在20 h為最佳。

    3.3pH調(diào)節(jié)方式對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響

    按3.1方法制取的新鮮廢菌渣固形物水解液,pH較低,要用堿性物質(zhì)調(diào)pH。本試驗(yàn)分別采用了CaO、NaOH、NH3·H2O對(duì)廢菌渣固形物水解液回調(diào)pH至7.60~7.80。進(jìn)行發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

    表4 調(diào)pH的方式對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響Table 4 Effects of the methods of controlling pH on thefermentation of ornithine

    可以看出,用氨水回調(diào)pH得到的L-鳥(niǎo)氨酸含量最高為36.87 g/L,可能是用其它兩種物質(zhì)回調(diào)pH,帶來(lái)了大量的Na+和Ca2+,Na+較多,會(huì)對(duì)鈉、鉀ATP酶系統(tǒng)造成影響,而ATP水解直接偶聯(lián)L-鳥(niǎo)氨酸的運(yùn)輸,雖然CaSO4微溶于水,但是Ca2+可以和磷酸鹽和磷酸氫鹽反應(yīng)生成沉淀,在中性和堿性條件下尤為如此,這樣就會(huì)引起磷酸鹽的降低。

    故可知廢菌渣固形物水解液制備的工藝為溫度為90.0℃、6.0 mol/L硫酸溶液(mL):廢菌渣固形物(g)為1∶2.5、水解時(shí)間為20 h,將制取的水解液用氨水調(diào)解pH調(diào)至7.60~7.80。

    3.4添加廢菌渣固形物水解液含量的確定

    L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵水平的高低和廢菌渣固形物水解液用量之間存在著密切關(guān)系,即L-鳥(niǎo)氨酸的產(chǎn)量會(huì)隨著廢菌渣固形物水解液的濃度發(fā)生改變。添加廢菌渣固形物水解液含量的梯度試驗(yàn)對(duì)于確定添加廢菌渣固形物水解液的最佳含量十分必要。按1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的配方在100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基上依次用3.5、5.0、6.5、8.0、9.5 g硫酸廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源,以酵母膏為有機(jī)氮源設(shè)置對(duì)照組,檢測(cè)發(fā)酵結(jié)果,試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

    表5 廢菌渣固形物水解液含量對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響Table 5 Effects of the hydrolysate content of the fermentation residues

    從表5可以看出發(fā)酵液OD值隨廢菌渣固形物水解液的增加而遞增,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中含廢菌渣固形物水解液6.5 g/100 mL,L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量最高,達(dá)到了37.47 g/L,說(shuō)明了用自制廢菌渣固形物水解液取代發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母膏是成功的,試驗(yàn)結(jié)果超過(guò)了對(duì)照組發(fā)酵培養(yǎng)基的水平,可能是因?yàn)閺U菌渣固形物水解成水解液之后,沒(méi)有經(jīng)過(guò)較大的后續(xù)處理,直接當(dāng)作有機(jī)氮源使用,其營(yíng)養(yǎng)成分比經(jīng)過(guò)后續(xù)處理的酵母膏豐富所致。

    3.5連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的研究

    第1批按1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,氨水調(diào)節(jié)初始pH至7.6~7.8,按5%接種量將種子液接入裝有50mL的發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,8層紗布封口,置于旋轉(zhuǎn)式搖床上(220 r/min),30℃振蕩培養(yǎng)72 h。檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中最大OD及72 h鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量,發(fā)酵后期收集廢菌渣固形物,制備成具體水解液后,按6.5 g/100 mL廢菌渣固形物水解液量加到發(fā)酵液中,其他按第1批發(fā)酵情況進(jìn)行第2批發(fā)酵,以此類(lèi)推連續(xù)進(jìn)行到第8批發(fā)酵,分別檢測(cè)每批發(fā)酵過(guò)程中最大OD及72 h鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量。以發(fā)酵批數(shù)為橫坐標(biāo),以每批發(fā)酵過(guò)程中最大OD及72 h鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量為縱坐標(biāo)繪圖。繪制結(jié)果如圖1所示。

    圖1 不同批次發(fā)酵過(guò)程中最大OD及L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量Fig.1 Maximum OD and production of L-ornithine in different batches of fermentation

    由圖1所示可知用水解溫度為90.0℃,6.0 mol/L硫酸溶液(mL):廢菌渣固形物(g)為1∶2.5,水解時(shí)間20 h以上,廢菌渣固形物水解液加入量為6.5 g/100 mL的條件進(jìn)行發(fā)酵,由多批次發(fā)酵過(guò)程中最大OD值和L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量表明菌體生物量穩(wěn)定,鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量穩(wěn)定,表明該工藝可行。

    4 總結(jié)

    本文主要研究了L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣固形物水解液的制備工藝,并將其回用于L-鳥(niǎo)氨酸的發(fā)酵工藝上,得出如下結(jié)論:

    1)通過(guò)正交試驗(yàn)法和單因素試驗(yàn)法,對(duì)直接利用含水廢菌渣固形物制取廢菌渣固形物水解液的操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,并確定了廢菌渣固形物水解液替代酵母膏的最佳用量、水解廢菌渣固形物的時(shí)間和調(diào)pH的最佳方式,達(dá)到用酵母膏時(shí)的產(chǎn)酸水平。得到L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣固形物水解液回用工藝最佳條件為:水解溫度為90.0℃、6.0 mol/L硫酸溶液(mL)與含水廢菌渣固形物(g)之比為1∶2.5、水解液加入量為6.5 g/100 mL。

    2)通過(guò)連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵,其L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量穩(wěn)定。

    3)分別以酵母膏為有機(jī)氮源和以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基檢測(cè),L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量相差無(wú)幾,完全可以用廢菌渣固形物水解液代替酵母膏進(jìn)行鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵生產(chǎn)。

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    DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.025

    收稿日期:2015-08-05

    作者簡(jiǎn)介:耿曉玲(1981—),女(漢),講師,碩士,研究方向:食品工程、食品安全。

    Study on Reuse Process of Hydrolysis Solids of L-ornithine Fermentation Residues

    GENG Xiao-ling1,CAI Li1,WANG Jun-hua2,WANG Peng1
    (1.Department of Chemical and Textile Engineering,Jiangyin Polytechnic College,Jiangyin 214431,Jiangsu,China;2.Food Safety Testing Center of Jiangyin District,Jiangyin 214431,Jiangsu,China)

    Abstract:Hydrolysis solids of L-ornithine fermentation residues were used as the organic nitrogen source to study the production of L-ornithine by fermentation.The optimized conditions of reuse process were as follows:hydrolysis time 20 h,hydrolysis temperature 90.0℃,hydrolysate 6.5 g/100 mL,the ratio was 1∶2.5 of 6.0 mol/L H2SO4solution(mL):fungi residues solids containing water(g).Finally,37.47 g/L of L-ornithine was obtained under these conditions,which was no difference compared with the control group.The yield of the L-ornithine obtained from the continuous reuse process was stable.

    Key words:L-ornithine;fermentation residues;orthogonal array design;process conditions

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