湘江四環(huán)素及抗性基因含量特征及其季節(jié)變化

范長征等

摘要：采用高效液相色譜質(zhì)譜法分析了湘江長沙河段水體及底泥中4種常見四環(huán)素類抗生素的含量特征及其季節(jié)變化，并采用實時熒光定量PCR研究了該水域相應(yīng)的5種代表性抗生素抗性基因（tet A，tet C，tet G，tet M和tet X）的存在及豐度.結(jié)果表明，水體中四環(huán)素類抗生素的質(zhì)量濃度均值在16.23～496.73 ng·L-1之間，底泥中四環(huán)素類抗生素的質(zhì)量分數(shù)為347.77～3 829.75 ng·kg-1，易受季節(jié)變化影響.5種目標抗性基因在所有樣品中均有檢出，其中tet A和tet C的絕對拷貝數(shù)及相對豐度較高，為湘江長沙河段的優(yōu)勢抗性基因.相關(guān)性分析表明：冬季水體中的tet A和tet C含量與底泥中的含量顯著相關(guān)，幾種目標抗生素與抗性基因之間并不存在明顯線性關(guān)系.

關(guān)鍵詞：基因；湘江；四環(huán)素抗生素

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A

Abstract： This paper adopted highperformance liquid chromatographymass spectrograph （HPLCMS） to investigate the occurrence and seasonal changes of tetracycline antibiotics in the Xiang River and its sediments. Five representative antibiotic resistance genes （tet A， tet C， tet G， tet M， tet X） in water and sediment samples were quantified with realtime PCR. The concentrations of tetracycline showed sensitive seasonal changes， ranging from 16.23 ng·L-1 to 496.73 ng·L-1 in the water samples， and from 347.77 ng·kg-1 to 3 829.75 n·kg-1 in the sediment samples， respectively. The target resistance genes were detected in all samples. Compared with other resistance genes， tet A and tet C were higher in absolute copy number and relative abundance， suggesting that the tet A and tet C were dominant in the Xiang River. Statistical analysis indicated a positive correlation between the relative abundance of tet A and tet C in the water samples and the sediment samples in winter. There was no linearly relationship between antibiotics and resistance genes.

Key words： genes；the Xiang River； tetracycline

近年來，抗生素及抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes，ARGs）污染已經(jīng)成為日益嚴峻的全球性環(huán)境問題[1-2].

四環(huán)素類抗生素具有廣譜性、質(zhì)優(yōu)價廉等優(yōu)點，是目前應(yīng)用最廣泛用量最大的抗生素種類之一[3].該類抗生素對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和衣原體等微生物發(fā)揮作用，具有廣譜抗菌性和良好的治療效果.四環(huán)素類抗生素主要包括四環(huán)素（Tetracyline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和強力霉素（Doxycycline，DOX）等，這些抗生素不僅廣泛應(yīng)用于醫(yī)療，還作為獸藥大量用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[4].中國是四環(huán)素類抗生素生產(chǎn)、銷售和使用的大國，年出口量高達1.34×107kg.湘江是長江七大支流之一，也是長沙市飲用水的主要來源.湘江長沙河段周邊居民超過700萬，周邊畜禽養(yǎng)殖場和醫(yī)療機構(gòu)密集，在醫(yī)療及養(yǎng)殖業(yè)中均普遍存在大量使用抗生素的問題.2009年僅長沙主城區(qū)共有72個主要排污口，每天至少將20萬噸生活污水、醫(yī)藥廢水、養(yǎng)殖廢水和工業(yè)廢水直接排入湘江及其支流，導(dǎo)致湘江水質(zhì)不斷惡化，嚴重影響了市民健康與經(jīng)濟的發(fā)展.但截至目前為止，關(guān)于湘江流域水體和底泥中抗生素及ARGs污染特征的研究還未見報道.因此，亟待開展湘江水體及底泥中抗生素含量及ARGs豐度的調(diào)查，以反映湘江抗生素及ARGs的污染現(xiàn)狀.本研究選取了湘江長沙河段上游至下游10個采樣點，分別采用高效液相色譜質(zhì)譜法和實時熒光定量PCR法對湘江長沙河段流域及其支流水體和底泥中4種四環(huán)素類抗生素（TC，OTC，CTC和DOX）和5種典型ARGs（tet A，tet C，tet G，tet M和tet X）進行分析研究.此外，還探討了ARGs和抗生素濃度之間的關(guān)系，以期為闡明中國水環(huán)境四環(huán)素類抗生素及ARGs的環(huán)境狀況提供科學(xué)依據(jù).

1材料與方法

1.1樣品采集

本研究采集了湘江長沙河段及其主要支流的江水和底泥樣本.從上游至下游共設(shè)10個采樣點，距離城市污水處理廠、醫(yī)院農(nóng)業(yè)灌溉區(qū)和養(yǎng)魚場等區(qū)域10～20 km，編號分別為S1～S7（湘江）和T1～T3（湘江主要支流），采樣點分布如圖1所示.在每個采樣點及采樣點上下游50 m處分別采集2.5 L距河面約0.5 m 深處的水樣，100 g 河流底泥，然后將3個水樣和底泥樣品分別混合，水樣裝入棕色滅菌玻璃瓶中于4 ℃ 條件下保存，河流底泥樣品裝入無菌密實袋中于-18 ℃條件下保存.

1.2四環(huán)素類抗生素檢測

所有水樣通過0.45 μm 濾膜（Waters 公司）后，按1 000 mL水加入0.5 mg Na2EDTA，加入鹽酸調(diào)pH至3.0.取經(jīng)過預(yù)處理的樣品提取液各10 mL經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水活化的Oasis HLB進行固相萃取富集后，依次用 5 mL水和 5 mL V甲醇∶V水=5∶95溶液淋洗.減壓抽干 5 min，最后用10 mL V甲醇∶V乙酸乙酯=10∶90溶液洗脫.將洗脫液在40 ℃吹氮、濃縮至干，用1 mL標準溶液溶解殘渣，過0.45 μm濾膜，供高效液相色譜質(zhì)譜儀測定.

將底泥樣品冷凍干燥后破碎至0.30 mm粒徑，稱取4 g放入錐心瓶中，加入20 mL EDTAMcllvaine緩沖溶液，振蕩30 min，取上層提取液.反復(fù)提取3次，用0.45 μm濾膜過濾，其余操作同水樣.

選取4種常見四環(huán)素類抗生素包括四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）和強力霉素（DOX）.依照冀秀玲等[1]報道方法，利用高效液相色譜質(zhì)譜儀（Agilent 1100）檢測水樣及河流底泥樣品中的目標抗生素含量.

1.3抗生素抗性基因（ARGs）檢測

1.3.1DNA提取

采用DNA提取試劑盒（TIANGEN，Beijing）提取底泥樣品及水樣中的DNA.提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證并用核酸蛋白儀檢測其濃度.目的DNA條帶單一，A260/280值在1.8～2.0之間，表明提取的DNA純度較高.

1.3.2普通PCR擴增

選取16SrDNA和5種四環(huán)素類抗性基因tet A，tet C，tet G，tet M和tet X作為目的基因，抗性基因引物設(shè)計參考已發(fā)表的文獻[5].PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μL，2 × Plus PCR MasterMix （TIANGEN， Beijing） 12.5 μL，下游引物（25 μM）各0.5 μL，ddH2O，10.5 μL，總體積25 μL.PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，然后95 ℃ 30 s，退火溫度30 s（表1），72 ℃ 45 s，循環(huán)35次，最后72 ℃ 5 min.PCR在MyCycler thermal cycle （BioRad，America）上進行，每組目的基因擴增反應(yīng)重復(fù)3次，每次設(shè)置兩組無模板陰性對照.

1.3.3ARGs定量分析

對上述PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，割膠回收、純化.將目的DNA片段與pGMT載體連接后，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞.挑選菌落培養(yǎng).使用高純度小量質(zhì)粒提取試劑盒（Bio Teke，Beijing）提取質(zhì)粒.將提取的質(zhì)粒用核酸蛋白質(zhì)測定儀（eppendorf）檢測含量及濃度.按10倍濃度梯度稀釋，繪制標準曲線（r2>0.990 0）.定量PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μL，2 × SYBR realtime PCR premixture （Bio Teke，Beijing） 10 μL，下游引物（25 μM）各0.5 μL，ddH2O 8 μL，總體積20 μL.定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 10 s，退火溫度（表1）15 s，72 ℃ 15 s，35個循環(huán)，78 ℃ 26 s.定量PCR在iCycler IQ5 Thermocycler （BioRad，America）上進行，每組目的基因擴增反應(yīng)重復(fù)3次，每次設(shè)置兩組無模板陰性對照.由樣本中目的基因的絕對拷貝數(shù)和內(nèi)參基因16SrDNA絕對拷貝數(shù)的比值得到基因相對豐度.基因相對豐度代表的是微生物群落中所含的抗性基因數(shù)量，更能反映基因在樣本中的分布情況.

2結(jié)果與討論

2.1抗生素含量水平

表2列出了4種四環(huán)素類抗生素在湘江長沙河段水體及底泥中的含量.結(jié)果顯示，無論在夏季（6月）還是冬季（12月），湘江長沙河段水體及底泥中各種四環(huán)素類抗生素（強力霉素除外）均有不同程度檢出，說明湘江長沙河段流域已廣泛受到四環(huán)素類抗生素的污染.底泥樣品中四環(huán)素類抗生素質(zhì)量分數(shù)均值為347.77～3 829.75 ng·kg-1，遠高于水體中抗生素質(zhì)量濃度均值16.23～496.73 ng·L-1，與之前報道的黃浦江[6]和海河[7]流域抗生素含量的檢測結(jié)果類似，表明河流沉積物已經(jīng)成為四環(huán)素類抗生素重要的蓄積池.沈群輝等[6]測得黃浦江底泥樣品中抗生素質(zhì)量濃度均值為江水中的15～130倍；Zhou等[8]在海河底泥中檢測到高濃度四環(huán)素含量，Luo等[7]卻發(fā)現(xiàn)海河水體中四環(huán)素含量低于檢測下限.水體環(huán)境中四環(huán)素類藥物檢出率和檢測水平較底泥低，可能是由于四環(huán)素類藥物在土壤、黏粒，包括沉積物中都有很強的吸附性，易在河流底泥中蓄積[9].本研究中，湘江長沙河段水體及底泥中四環(huán)素和土霉素的檢出率達到100%，遠高于其他國家和地區(qū)的檢出率[10-11]，這在一定程度上反映了湘江長沙河段周邊區(qū)域四環(huán)素類抗生素的大量使用和排放.從表2可以看出，湘江長沙河段水體中冬季的四環(huán)素類抗生素質(zhì)量濃度明顯高于夏季.12月水體中的四環(huán)素平均質(zhì)量濃度為412.65 ng·L-1，約為6月份的25倍；12月水體中土霉素質(zhì)量濃度均值為496.73 ng·L-1，約為6月的16倍；12月水體中金霉素平均質(zhì)量濃度為23.55 ng·L-1，但是6月水體中沒有檢測到金霉素.湘江長沙河段冬季水體中四環(huán)素類抗生素含量明顯高于夏季，可能是由以下幾個原因引起：一是冬季是湘江的枯水期，江水水量小，流速慢，抗生素被水流稀釋的速率減慢導(dǎo)致水體中抗生素濃度增大；二是冬季是感冒等疾病的多發(fā)季節(jié)，人畜抗生素用量也隨之加大，導(dǎo)致排入環(huán)境中的抗生素量大大增加；三是冬季溫度較低時，微生物的增殖活動和新陳代謝減緩，對環(huán)境中抗生素的吸附、轉(zhuǎn)移和降解能力減弱.Yang等[12]研究了珠江水體和沉積物中抗生素的空間及季節(jié)變化規(guī)律，Kim S C等[13]研究了美國科羅拉多州北部科林斯堡河沿線5個不同功能區(qū)的水體和沉積物中15種抗生素的變化規(guī)律，結(jié)果均顯示水體中抗生素的含量水平受季節(jié)變化影響大，冬季水體中抗生素含量和檢出率明顯高于夏季，但底泥中抗生素含量水平受季節(jié)變化影響不大.

2.2抗性基因定量PCR結(jié)果

圖2為水樣及底泥樣本中16SrDNA和5種目標ARGs（tet A，tet C，tet G，tet M，tet X）的豐度.

通過PCR研究發(fā)現(xiàn)湘江長沙河段底泥中微生物濃度遠高于水體中的濃度，水體和底泥中的16SrDNA豐度均受到季節(jié)變化影響，6月測得的16SrDNA豐度約為12月的15倍.夏季較高的水體溫度、營養(yǎng)利用率以及較低水平的抗生素含量都會促進微生物生長繁殖，因此夏季環(huán)境中16SrDNA豐度提高.本研究在所有的樣品中均檢測到目的抗性基因tet A，tet C，tet G，tet M和tet X，其中tet A和tet C在樣本中的相對豐度較高，為湘江長沙河段的優(yōu)勢抗性基因（圖3）.水體和底泥中tet A與內(nèi)參基因16SrDNA的比值分別為1.5×10-3～6.7×10-3和1.0×10-4～1.3×10-4，tet C在江水和底泥中與內(nèi)參基因16SrDNA的比值為2.1×10-3～7.3×10-3和8.2×10-5～1.9×10-4，其相對豐度與國外污水處理系統(tǒng)中的基因豐度相當(dāng)[14].

楊穎等[15]調(diào)查了北江流域四環(huán)素抗性基因的污染情況，發(fā)現(xiàn)在所檢出的四環(huán)素抗性基因中，含量最高的是tet C，與16SrDNA拷貝數(shù)比值范圍在8.3×10-2～13.20之間，其次是tet A.但是Hu Y等[16]檢測了從北京文峪河流域分離得到的大腸桿菌中20種四環(huán)素類抗生素抗性基因，結(jié)果表明抗性基因tet A，tet B，tet M的含量占到了90%，tet C含量水平卻很低.不同地區(qū)呈現(xiàn)出的不同ARGs污染特征，可能與當(dāng)?shù)乜股氐氖┯?、殘留的環(huán)境選擇壓力密切相關(guān).此外，還發(fā)現(xiàn)，冬季河流流速較緩慢的情況下，湘江長沙河段水體中的優(yōu)勢抗性基因tet A和tet C與底泥中的tet A和tet C含量顯著相關(guān)（圖4），表明湘江水體和底泥中的ARGs處在動態(tài)平衡中，即使在相對靜態(tài)的環(huán)境中，水體中的抗藥菌和ARGs也會向底泥遷移，同理，底泥中的抗藥菌和ARGs也會向水體中遷移[17].研究還發(fā)現(xiàn)，支流水體中tet A和tet C的豐度普遍高于主干流（表3），這個結(jié)果是符合實際情況的.農(nóng)田灌溉廢水、畜牧養(yǎng)殖污水、城市污水直接排入江河支流，使支流成為ARGs形成和傳播擴散的重要場所，也使支流成為直接向江河干流輸送ARGs的源頭.Luo等[7]測得中國海河流域支流中的Sul 1，Sul 2和磺胺類抗生素的含量遠高于主干流，Pruden A等[18]對美國科林斯堡河流域進行調(diào)查也有類似發(fā)現(xiàn).

2.3四環(huán)素類抗生素與ARGs相關(guān)性分析

夏季由于強烈的光解作用、生物降解和快速的水體流動，使得環(huán)境中抗生素濃度相對較低.本研究中，夏季水體中四環(huán)素類抗生素的總濃度均值為47.90 ng·L-1，而冬季水體中則為932.93 ng·L-1；夏季底泥中四環(huán)素類抗生素的總濃度均值為2 777.98 ng·kg-1，而冬季底泥中則為6 756.06 ng·kg-1.夏季環(huán)境中抗生素質(zhì)量濃度低可能導(dǎo)致ARGs相對豐度較低.理論上講，作為ARGs的直接

選擇因素，環(huán)境中誘導(dǎo)抗生素的含量水平會直接影響ARGs的相對豐度[19].但是，本研究對四環(huán)素類抗生素濃度與抗性基因相對豐度進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示幾種目標抗生素與抗性基因之間并不存在明顯線性關(guān)系（結(jié)果未列出）.已有研究顯示，除誘導(dǎo)抗生素含量水平外，ARGs豐度還可能受環(huán)境因子及其他污染物等因素的影響，如微生物生長速率、轉(zhuǎn)運子、供氧條件、光照條件、溫度變化、重金屬和pH等.Rysz等[20]發(fā)現(xiàn)抗性基因在有利于微生物新陳代謝的環(huán)境中更容易保存下來，大腸桿菌在厭氧條件下更容易丟失抗性基因.Engemann等[17]比較了光照和黑暗條件下畜牧業(yè)污水中四環(huán)素類抗性基因的遷移和衰減情況，表明光照會促進ARGs的降解，并且不同的抗性基因受到光照影響的程度不相同.Pei R等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)厭氧處理和高溫條件有利于降低水體中ARGs的含量水平.大量報道表明，環(huán)境中的重金屬污染對抗生素抗性的保持和增殖有重要作用，重金屬可與抗生素形成協(xié)同抗性，使微生物群落產(chǎn)生多重抗性，從而導(dǎo)致環(huán)境中ARGs豐度升高[21].目前，在自然環(huán)境中已分離得到多株具有抗生素和金屬離子雙重抗性的細菌.Sinha等[22]從印度德里污水處理廠水體中分離得到的大腸桿菌（Escherichia coli）、假單胞菌（Pseudomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）和金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）既有對鋅、鉛、鎘等重金屬的抗性，也有對四環(huán)素的抗性.湘江長沙河段水體和底泥中重金屬復(fù)合污染嚴重，鎘、鉛、砷含量嚴重超標[23-25]，這些因素可能會對抗生素抗性基因的形成、水平轉(zhuǎn)移和擴增起到積極作用，從而加劇湘江流域的ARGs污染.

3結(jié)論

1）湘江長沙河段水體及底泥已經(jīng)廣泛受到四環(huán)素類抗生素的污染，本研究所檢測的4種四環(huán)素類抗生素（強力霉素除外）在所有樣品中均有檢出，說明湘江長沙河段周邊區(qū)域四環(huán)素類抗生素濫用情況相當(dāng)嚴重.底泥中四環(huán)素類抗生素含量水平總體要高于水體，這可能與四環(huán)素類抗生素與粘土有較強的吸附性有關(guān).數(shù)據(jù)還表明，水體中抗生素含量水平易受季節(jié)變化影響，冬季水體中抗生素含量明顯高于夏季.

2）湘江長沙河段水體及底泥中，5種目的抗性基因均有檢出，tet A和tet C相對豐度最高，為水域中的優(yōu)勢抗性基因.研究還發(fā)現(xiàn)冬季水體與底泥中的tet A和tet C含量顯著相關(guān)，表明湘江水體和底泥中的ARGs處在動態(tài)平衡中.

3）水體及底泥中ARGs與抗生素相關(guān)性分析顯示，目標抗生素與抗性基因之間并不存在明顯的線性關(guān)系，說明ARGs豐度不僅僅受導(dǎo)抗生素含量影響.

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