一種來源于運(yùn)動替斯崔納菌KA081020-065的新型鹵醇脫鹵酶的表達(dá)純化及性質(zhì)分析

王雷，袁京，姚培圓，程麗華，解美仙，賈榮榮，馮進(jìn)輝，王敏，吳洽慶，朱敦明

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一種來源于運(yùn)動替斯崔納菌KA081020-065的新型鹵醇脫鹵酶的表達(dá)純化及性質(zhì)分析

王雷1,2，袁京2，姚培圓2，程麗華3，解美仙3，賈榮榮3，馮進(jìn)輝2，王敏1，吳洽慶2，朱敦明2

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457 2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室天津市生物催化技術(shù)工程中心，天津 300308 3 河北誠信有限責(zé)任公司，河北石家莊 051130

王雷, 袁京, 姚培圓, 等. 一種來源于運(yùn)動替斯崔納菌KA081020-065的新型鹵醇脫鹵酶的表達(dá)純化及性質(zhì)分析. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(5): 659–669.Wang L, Yuan J, Yao PY, et al. Expression and characterization of a novel halohydrin dehalogenase from Tistrella mobilis KA081020-065. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 659–669.

鹵醇脫鹵酶 (Halohydrin dehalogenase) 不僅對于含氯污染物的生物降解、凈化環(huán)境具有重要意義，而且在手性醫(yī)藥中間體合成中也是一種重要的生物催化劑，但其數(shù)量較少。采用基因挖掘在基因組數(shù)據(jù)庫中獲得一種來自運(yùn)動替斯崔納菌KA081020-065的新型鹵醇脫鹵酶基因，將該基因克隆、表達(dá)在大腸桿菌BL21 (DE3) 中，利用鎳柱親和層析將該酶進(jìn)行純化并研究了其酶學(xué)性質(zhì)。HheTM是一種同源四聚體；最適溫度為50 ℃；不同的 pH 緩沖液對其活性有較大影響；在堿性、30 ℃以下的條件下穩(wěn)定性高。在氰根離子存在的條件下，HheTM能夠催化-4-氯-3-羥基丁酸乙酯合成-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，為酶法合成阿托伐他汀關(guān)鍵中間體提供了一種新的鹵醇脫鹵酶。

鹵醇脫鹵酶，運(yùn)動替斯崔納菌，-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯

鹵醇脫鹵酶 (EC 4.5.1.X) 又叫作鹵代醇環(huán)氧酶或鹵代醇鹵化氫裂解酶[1]，與鹵代烷脫鹵酶和鹵代酸脫鹵酶一樣，鹵醇脫鹵酶對于含氯污染物的生物降解、凈化環(huán)境具有重要意義。鹵醇脫鹵酶催化反應(yīng)時不需要任何輔酶，通過分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化碳-鹵鍵斷裂進(jìn)行脫鹵反應(yīng)，鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的環(huán)氧化物并釋放出鹵化氫 (圖1)，可用于手性的環(huán)氧化物的合成[2-3]；在親核試劑 (CN–，N3–，NO2–，SCN–，OCN–，HCOO–等) 存在的條件下，繼續(xù)催化環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)[4-6]，合成一系列光學(xué)純的β-取代醇[4]，因此，鹵醇脫鹵酶也是一類在有機(jī)合成中非常重要的生物催化劑。

圖1 鹵醇脫鹵酶催化鄰鹵醇脫鹵反應(yīng)和環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)

1968年首次以2,3-二溴丙醇作為唯一碳源，從土壤中分離出產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的微生物菌株——黃桿菌sp.[7]，隨后人們從土壤和淡水沉積物中相繼篩選得到多種產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的微生物，但來源于微生物的鹵醇脫鹵酶僅有10余種。根據(jù)序列同源性，鹵醇脫鹵酶通常被分為HheA、HheB、HheC 3類[8]，研究較多的鹵醇脫鹵酶包括來源于節(jié)桿菌sp. AD2的鹵醇脫鹵酶HheA-AD2[9-11]，來源于棒狀桿菌strain N-1074的鹵醇脫鹵酶HheA和HheB[12]，來源于土壤桿菌strainNHG3的鹵醇脫鹵酶DehB[13-14]，來源于分枝桿菌sp. strain GP1的鹵醇脫鹵酶HheB-GP1[8]，以及來源于放射形土壤桿菌AD1的鹵醇脫鹵酶HheC[8]等。其中，鹵醇脫鹵酶HheC和HheA-AD2的蛋白晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，結(jié)果顯示兩種酶均為四聚體[15-16]。進(jìn)一步對其反應(yīng)機(jī)理推斷，認(rèn)為鹵醇脫鹵酶是通過催化三聯(lián)體絲氨酸-酪氨酸-精氨酸 (S-Y-R) 進(jìn)行脫鹵反應(yīng)和開環(huán)反應(yīng)[17-18]。根據(jù)其蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)信息并結(jié)合模擬計算，對兩種鹵醇脫鹵酶都已進(jìn)行了分子改造[10,19-20]。目前報道的鹵醇脫鹵酶分子量大小為20–35 kDa，在pH 8.0–9.5范圍內(nèi)保持較高的活性，最適的溫度范圍為40–50 ℃，并且某些金屬離子 (如Cu2+、Zn2+、Hg+等) 會抑制其活性[1]；鹵醇脫鹵酶已應(yīng)用于-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(Ethyl-4-cyano-3-hydroxy-butyrate，-HN) 的生物催化合成中[20-21]，而-HN是合成阿托伐他汀[22](Atorvastatin，商品名Lipitor，年銷售額百億美元的降血脂處方藥) 手性側(cè)鏈的關(guān)鍵中間體。

由于鹵醇脫鹵酶數(shù)量較少，并且同一類鹵醇脫鹵酶之間的序列同源性很高，所以尋找與已有3類鹵醇脫鹵酶同源性低的新一類鹵醇脫鹵酶具有重要意義。本文通過基因數(shù)據(jù)挖掘 (Genome mining)，獲得一種來源于運(yùn)動替斯崔納菌[23]KA081020-065的新型鹵醇脫鹵酶HheTM，根據(jù)序列同源性分類，該酶不屬于已有的3類鹵醇脫鹵酶。我們將該酶進(jìn)行了表達(dá)純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。為了進(jìn)一步確認(rèn)該酶是一種新的鹵醇脫鹵酶，利用該酶進(jìn)行生物催化-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(Ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate，-ECHB) 的脫氯反應(yīng)，反應(yīng)過程中添加親核試劑CN–，獲得了阿托伐他汀的關(guān)鍵中間體-HN。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及主要試劑

pET-32a(+) 質(zhì)粒購自Novagen公司；FastDigest限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；蛋白胨和酵母提取物均購自BD公司；Bradford BCA蛋白濃度試劑盒購自康為世紀(jì)公司；考馬斯亮藍(lán)R250購自Solarbio公司；-4-氯-3-羥基丁酸乙酯、-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯等試劑均購自國藥集團(tuán)。

1.1.2 主要儀器

蛋白純化儀：?KTA purifier 10，所用層析柱均為GE公司；APV 2000高壓勻漿破碎儀購自德國APV公司；RC6+高速冷凍離心機(jī)購自Thermo公司；氣相色譜儀Agilent 7890A購自Agilent公司。

1.2 目的基因的合成

在美國國立生物技術(shù)信息中心 (NCBI) 數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) 中以“halohydrin dehalogenase”或“halohydrin hydrogen-halide-lyase”為檢索詞進(jìn)行檢索，得到可能的鹵醇脫鹵酶相關(guān)信息。通過BioEdit分析軟件的ClustalW多序列比對，分析候選的鹵醇脫鹵酶的保守序列，最終確定一種來源于運(yùn)動替斯崔納菌KA081020-065的鹵醇脫鹵酶 (GenBank登錄號為AFK51877.1) 為研究對象，將此鹵醇脫鹵酶命名為HheTM。通過在線的jcat密碼子優(yōu)化程序 (http://www.jcat.de)對HheTM的原始基因序列進(jìn)行了針對中表達(dá)的密碼子優(yōu)化，在C端加上6×His標(biāo)簽，目的基因由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。

1.3 目的蛋白的表達(dá)純化

目的基因構(gòu)建至pET-32a(+) 載體的Ⅰ(346 bp) 和dⅢ酶切位點(diǎn)之間，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞。將成功轉(zhuǎn)化的單克隆接種于20 mL含有終濃度100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)接到800 mL的LB培養(yǎng)基(100 μg/mL氨芐青霉素) 中，培養(yǎng)至600為1.0左右，向培養(yǎng)基中添加IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)10 h；于4 ℃、6 000×離心15 min收集菌體。用4 ℃預(yù)冷的緩沖液A (50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.5，500 mmol/L NaCl) 洗滌菌體一次，收集菌體進(jìn)行破碎或–20 ℃保存。

上述菌體用緩沖液A重懸，4 ℃高壓勻漿破碎。12 000 r/min離心30 min，收集上清液，用0.45 μm的濾膜過濾，Ni-NTA柱純化。先用緩沖液A洗滌，再用緩沖液B (50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.5，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑) 進(jìn)行梯度洗脫。選擇梯度為50 mmol/L、75 mmol/L、200 mmol/L咪唑，收集200 mmol/L咪唑的洗脫峰。所得純酶用Amicon Ultra-15超濾管 (截留分子量：10 kDa) 濃縮，緩沖液C (50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.5) 脫鹽后，用于后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)檢測。蛋白質(zhì)濃度用BCA試劑盒檢測，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)測定

1.4.1 分子量和酶活性測定

鹵醇脫鹵酶HheTM在溶液中的聚集狀態(tài)通過凝膠層析和SDS-PAGE來進(jìn)行確定。所用層析柱為Superdex 200 10/300 GL。流動相為20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，150 mmol/L NaCl，pH 7.2，流速為0.5 mL/min。蛋白的分子量大小通過和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的保留體積進(jìn)行計算得到，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為：Ovalbumin (43.0 kDa)，Conalbumin (75.0 kDa)，Conalbumin (158.0 kDa)，F(xiàn)erritin (440.0 kDa)，Thyroglobulin (669.0 kDa)。

以-ECHB作為底物進(jìn)行酶活的檢測，-ECHB在鹵醇脫鹵酶作用下生成-3,4-環(huán)氧丁酸乙酯 (Ethyl-3,4-expoxybutyrate，-EEB)。緩沖液為Na2HPO4-NaH2PO4(50 mmol/L， pH 8.0)，1 mL反應(yīng)體系中，包括40 mmol/L的底物-ECHB以及合適的酶量，30 ℃條件下反應(yīng)10 min，加入50 μL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，等體積乙酸乙酯萃取，所得有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后進(jìn)行氣相色譜分析。一個酶活單位 (U) 定義為每分鐘消耗1 μmol底物-ECHB所需的酶量。氣相色譜檢測條件為：Agilent 7890A，色譜柱19091J-413 HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測溫度220 ℃，升溫程序：80 ℃保持3 min，20 ℃/min升高到160 ℃保持1 min。此氣相條件下得到的-ECHB和-EEB的保留時間分別為2.3 min和4.4 min。

1.4.2 最適pH及pH穩(wěn)定性

HheTM的最適反應(yīng)pH通過在不同pH的緩沖液中測定酶的活力確定。緩沖液分別為50 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.0–8.0)，Tris-H2SO4緩沖液(pH 8.0–9.0)，Glycine-NaOH緩沖液(pH 9.0–10.0)，Na2HPO4-NaOH緩沖液(pH 10.0–11.0)?？瞻讓φ諡椴惶砑用傅姆磻?yīng)，每個pH值的實(shí)驗(yàn)均設(shè)置空白對照。以所測定不同pH緩沖液中的最高酶活作為100%酶活對照，其他pH條件下所測酶活以對照酶活的百分比表示。

HheTM的pH穩(wěn)定性是將酶在不同pH的緩沖液 (如上所述) 中，于25 ℃條件下孵育24 h，然后測定酶殘余活力，以不同pH下最初的酶活為100%酶活對照。

1.4.3 最適溫度及熱穩(wěn)定性

HheTM的最適反應(yīng)溫度通過測定底物-ECHB在Na2HPO4-NaH2PO4(50 mmol/L，pH 8.0) 緩沖液中不同溫度 (20–70 ℃) 下的酶活來確定?？瞻讓φ諡椴惶砑用傅姆磻?yīng)，每個溫度的實(shí)驗(yàn)均設(shè)置空白對照。以所測的不同反應(yīng)溫度下最高酶活為100%酶活 (對照)，其他溫度條件下所測酶活以對照酶活的百分比表示。

HheTM的熱穩(wěn)定性是用Na2HPO4-NaH2PO4(50 mmol/L，pH 8.0) 緩沖液配制適宜濃度的酶液，在不同溫度下分別孵育不同時間，然后檢測殘余酶活力。以不同溫度下最初的酶活為100%酶活對照。

1.4.4 底物特異性和動力學(xué)分析

HheTM的底物特異性通過替換反應(yīng)體系中的底物-ECHB為-ECHB、1,3-二氯-2-丙醇(1,3-Dichloro-2-propanol, 1,3-DCP)、4-氯-3-羥基丁腈 (4-Chloro-3-hydroxybutyronitrile)，濃度均為40 mmol/L，按照1.4.1中酶活檢測方法進(jìn)行測定，底物1,3-DCP和4-氯-3-羥基丁腈的檢測采用相應(yīng)的氣相色譜分析方法進(jìn)行，以底物-ECHB的酶活為100%對照。1,3-DCP及其環(huán)氧產(chǎn)物的氣相色譜分析條件為：Agilent 7890A，色譜柱19091J-413 HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測溫度220 ℃，升溫程序：50 ℃保持1 min，10 ℃/min升高到100 ℃保持1 min。1,3-DCP及其環(huán)氧產(chǎn)物的保留時間分別為4.1 min和2.3 min。4-氯-3-羥基丁腈檢測方法與-ECHB和-ECHB的氣相條件一樣，其保留時間為3.3 min，其環(huán)氧產(chǎn)物沒有標(biāo)品，但進(jìn)行酶活檢測發(fā)現(xiàn)，HheTM對其活性很低。

鹵醇脫鹵酶HheTM的動力學(xué)參數(shù)測定以-ECHB為底物，選用純化后的HheTM，底物濃度從10–60 mmol/L，按照1.4.1中酶活檢測方法進(jìn)行測定。

1.4.5 不同金屬離子及化學(xué)物質(zhì)對酶活的影響

不同的金屬離子和化學(xué)物質(zhì)加入到反應(yīng)體系中，并預(yù)先在30 ℃孵育30 min，然后按照1.4.1酶活檢測方法測定酶的殘余活力，空白對照 (100%) 為未添加任何物質(zhì)的酶活。金屬離子包括Fe2+、Mg2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+，均為硫酸鹽，其終濃度分別為1 mmol/L和5 mmol/L?；瘜W(xué)物質(zhì)包括Tween-80 (1%和5%)、EDTA (1 mmol/L和10 mmol/L)、SDS (1 mmol/L和10 mmol/L)。

1.5 利用鹵醇脫鹵酶HheTM生物合成-HN

利用鹵醇脫鹵酶HheTM作為催化劑，從-ECHB生物合成-HN。反應(yīng)體系為20 mL，選擇Tris-H2SO4緩沖液 (50 mmol/L，pH 9.0)，底物-ECHB濃度為10 g/L和20 g/L，使用pH在線調(diào)控系統(tǒng)，自動流加10%的NaCN溶液，控制反應(yīng)體系的pH維持在8.0–9.0，加入一定量純化后的鹵醇脫鹵酶HheTM (200 mg/L) 于30 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，每隔一定的時間取樣200 μL，用800 μL的乙酸乙酯萃取，所得有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后進(jìn)行氣相色譜儀分析。氣相色譜檢測條件與酶活測定方法中檢測條件一致，得到-ECHB和-HN的保留時間分別為4.4 min和5.6 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹵醇脫鹵酶序列比對及分析

通過對已有的鹵醇脫鹵酶進(jìn)行序列Blast分析后發(fā)現(xiàn)，同一類鹵醇脫鹵酶之間蛋白序列同源性很接近，其相似性為91%–98%；不同類的鹵醇脫鹵酶之間的Identity為24%–33% (表1)。然而我們新挖掘的HheTM與已有的3類鹵醇脫鹵酶的Identity在30%–38%之間，由此推測HheTM可能不屬于已有的3類鹵醇脫鹵酶，是一種新的鹵醇脫鹵酶。利用BioEdit軟件的ClustalW多重比對功能對以上所述的7種鹵醇脫鹵酶進(jìn)行序列比對。序列比對的結(jié)果如圖2所示，7種鹵醇脫鹵酶都含有鹵醇脫鹵酶的保守區(qū)-催化三聯(lián)體Ser-Tyr-Arg (S-Y-R)。由此推測HheTM可能具有鹵醇脫鹵酶的性質(zhì)，能夠催化鄰鹵醇類化合物的脫鹵反應(yīng)及其逆反應(yīng) (環(huán)氧化物開環(huán))。

表1 不同鹵醇脫鹵酶序列成對比較

圖2 鹵醇脫鹵酶序列比對結(jié)果

2.2 鹵醇脫鹵酶HheTM的表達(dá)及純化

將全基因合成的HheTM基因序列構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)-HheTM，在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá)，Ni-NTA 純化得到高純度的目的蛋白。HheTM的表達(dá)及純化結(jié)果見圖3，純化參數(shù)如表2所示。由圖3可知，HheTM單體的分子量約為26.0 kDa，凝膠層析結(jié)果顯示酶的分子量大約為101.2 kDa，說明其在溶液中以四聚體形式存在。

2.3 酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

鹵醇脫鹵酶催化鄰鹵醇形成相應(yīng)的環(huán)氧化物并導(dǎo)致鹵化氫的生成，導(dǎo)致pH值的下降，而鹵醇脫鹵酶發(fā)揮催化作用的pH條件為堿性條件，所以研究pH對鹵醇脫鹵酶HheTM的影響時，選擇的pH范圍為6.0–11.0。以-ECHB為底物，鹵醇脫鹵酶HheTM在不同pH的緩沖液中酶活差異較大，在pH 10.0的條件下酶活最高，而在pH<7.0的條件下，HheTM的活性很低 (圖4A)。HheTM的pH穩(wěn)定性顯示，在pH<7.0的條件下，HheTM孵育后的殘余活力基本為零，說明HheTM可能已經(jīng)失活。在pH >7.0的條件下，HheTM可以保持很高的穩(wěn)定性，24 h后酶殘余活力大于90% (圖4B)。

表2 HheTM蛋白純化結(jié)果

圖3 HheTM蛋白純化SDS-PAGE圖

2.4 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

HheTM在50 ℃表現(xiàn)出最高的活性，在35–50 ℃范圍內(nèi)，酶活力為峰值酶活的80%以上 (圖5A)。HheTM的溫度穩(wěn)定性顯示，HheTM在30 ℃條件下有很好的穩(wěn)定性，孵育12 h，酶活無損失，在40 ℃條件下，HheTM的半衰期約為8 h，而在50 ℃條件下孵育2 h，HheTM基本失活 (圖5B)，說明HheTM在50 ℃條件下酶活很高，但其穩(wěn)定性很差。

2.5 底物特異性及動力學(xué)分析

HheTM對于不同底物活性檢測結(jié)果見表3，HheTM對于-ECHB和-ECHB底物均有活性。在檢測的4種底物中，HheTM對于底物-ECHB的活性最高，而對于底物4-氯-3-羥基丁腈活性很低。以-ECHB為底物測定動力學(xué)參數(shù)m和cat，結(jié)果如表4所示。

圖4 pH對鹵醇脫鹵酶HheTM的影響

圖5 溫度對鹵醇脫鹵酶HheTM的影響

表3 鹵醇脫鹵酶HheTM的底物特異性

2.6 不同化學(xué)物質(zhì)對酶活性的影響

不同金屬離子對HheTM活性的影響結(jié)果如表5所示，不同的金屬二價離子均抑制了HheTM的活性，F(xiàn)e2+、Zn2+、Cu2+離子對HheTM活性的影響作用尤為明顯。表6顯示，10 mmol/L的SDS的加入可以完全抑制HheTM的活性，而5%的Tween-80對HheTM的活性基本無影響，EDTA輕度抑制了HheTM的活性。

表4 鹵醇脫鹵酶HheTM的動力學(xué)參數(shù)

表5 金屬離子對HheTM酶活的影響

表6 表面活性劑和抑制劑對HheTM酶活的影響

2.7 幾種不同鹵醇脫鹵酶的性質(zhì)比較

本文中介紹的鹵醇脫鹵酶HheTM與文獻(xiàn)中報道的幾個鹵醇脫鹵酶簡單的性質(zhì)比較見表7。通過比較發(fā)現(xiàn)，新的鹵醇脫鹵酶HheTM分子量與HheB-GP1相近；最適溫度與HheA-AD2和HheC的最適溫度相同，均為50 ℃；與鹵醇脫鹵酶DehB一樣，Zn2+和Cu2+也是HheTM的抑制劑。

表7 幾種不同鹵醇脫鹵酶的性質(zhì)比較

/not mentioned.

2.8 利用鹵醇脫鹵酶HheTM生物合成-HN

堿性是鹵醇脫鹵酶發(fā)揮脫鹵作用以及形成親核試劑氰離子 (HCN的pKa值大約為9) 的必要條件。然而，-ECHB和-HN都是對堿性敏感的化合物，從而導(dǎo)致反應(yīng)過程中副產(chǎn)物的產(chǎn)生[21]。由于HheTM 是新挖掘到的鹵醇脫鹵酶，選擇較低的底物濃度 (10 g/L和20 g/L) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200 mg/L的酶量可以實(shí)現(xiàn)10 g/L的底物-ECHB轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物-HN，30 ℃反應(yīng)10 h，-ECHB轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%。然而，對于20 g/L的底物，-ECHB轉(zhuǎn)化率只能達(dá)到75%左右 (圖6)。

3 結(jié)論

通過基因挖掘獲得了來源于運(yùn)動替斯崔納菌KA081020-065的新型鹵醇脫鹵酶基因，該酶與已有的3類鹵醇脫鹵酶同源性很低，屬于新的鹵醇脫鹵酶。將該酶在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，HheTM是一種同源四聚體；最適溫度為50 ℃；不同的pH值緩沖液對其活性有較大影響；在堿性、30 ℃以下的條件下穩(wěn)定性高。該酶能夠催化-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，反應(yīng)過程中加入CN–，可以合成阿托伐他汀關(guān)鍵中間體-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。生物催化反應(yīng)體系的底物濃度為10 g/L，酶濃度為200 mg/L，30 ℃反應(yīng)10 h，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%。HheTM對于-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的催化活性與文獻(xiàn)中利用分子改造后的鹵醇脫鹵酶HheC[18]相比還有一定的差距。該酶與已知鹵醇脫鹵酶同源性較低，可能具有獨(dú)特的底物譜和催化性質(zhì)，在其他β-取代醇的合成中可能具有更好的應(yīng)用價值和潛力，對底物譜進(jìn)行擴(kuò)大研究，也許有新發(fā)現(xiàn)。

圖6 (R)-HN的生物合成時間曲線圖

REFERENCES

[1] You ZY, Liu ZQ, Zheng YG. Properties and biotechnological applications of halohydrin dehalogenases: current state and future perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(1): 9–21.

[2] Assis HMS, Bull AT, Hardman DJ. Synthesis of chiral epihalohydrins using haloalcohol dehalogenase A fromH10a. Enzyme Microb Technol, 1998, 22(7): 545–551.

[3] Jin HX, Hu ZC, Liu ZQ, et al. Nitrite-mediated synthesis of chiral epichlorohydrin using halohydrin dehalogenase fromAD1. Biotechnol Applied Biochem, 2012, 59(3): 170–177.

[4] Hasnaoui DG, Majeric EM, Lutje Spelberg JH, et al. Catalytic promiscuity of halohydrin dehalogenase and its application in enantioselective epoxide ring opening. Chembiochem, 2008, 9(7): 1048–1051.

[5] Hasnaoui DG, Lutje Spelberg JH, De Vries EJ, et al. Nitrite-mediated hydrolysis of epoxides catalyzed by halohydrin dehalogenase fromAD1: a new tool for the kinetic resolution of epoxides. Tetrahedron Asymmetry, 2005, 16(9): 1685–1692.

[6] Hopmann KH, Himo F. Cyanolysis and azidolysis of epoxides by haloalcohol dehalogenase theoretical study of the reaction mechanism and origins of regioselectivity. Biochemistry, 2008, 47(17): 4973–4982.

[7] Castro CE, Bartnicki EW. Biodehalogenation, epoxidation of halohydrins, epoxide opening, and transhalogenation by asp.. Biochemistry, 1968, 7(9): 3213–3218.

[8] van Hylckama Vlieg JET, Tang LX, Lutje Spelberg JH, et al. Halohydrin dehalogenases are structurally and mechanistically related to short-chain dehydrogenases/reductases. J Bacteriol, 2001, 183(17): 5058–5066.

[9] Tang LX, Jiang RC, Zheng K, et al. Enhancing the recombinant protein expression of halohydrin dehalogenase HheA inby applying a codon optimization strategy. Enzyme Microb Technol, 2011, 49(4): 395–401.

[10] Tang LX, Zhu XC, Zheng HY, et al. Key residues for controlling enantioselectivity of halohydrin dehalogenase fromsp. strain AD2, revealed by structure-guided directed evolution. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(8): 2631–2637.

[11] Vandenwijngaard AJ, Reuvekamp PTW, Janssen DB. Purification and characterization of haloalcohol dehalogenase fromsp. strain AD2. J Bacteriol, 1991, 173(1): 124–129.

[12] Nakamura T, Nagasawa T, Yu F, et al. Characterization of a novel enantioselective halohydrin hydrogen-halide-lyase. Appl Environ Microbiol, 1994, 60(4): 1297–1301.

[13] Higgins KH, Hope SJ, Effendi AJ, et al. Biochemical and molecular characterisation of the 2,3-dichloro-1-propanol dehalogenase and stereospecific haloalkanoic dehalogenases from a versatilesp.. Biodegradation, 2005, 16(5): 485–492.

[14] Effendi AJ, Greenaway SD, Dancer BN. Isolation and characterization of 2,3-dichloro-1-propanol- degrading. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(7): 2882–2887.

[15] de Jong RM, Kalk KH, Tang L, et al. The X-ray structure of the haloalcohol dehalogenase HheA fromsp. strain AD2: insight into enantioselectivity and halide binding in the haloalcohol dehalogenase family. J Bacteriol, 2006, 188(11): 4051–4506.

[16] de Jong RM, Rozeboom HJ, Kalk KH, et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of an enantioselective halohydrin dehalogenase fromAD1. Acta Crystallogr D, 2002, 58(1): 176–178.

[17] Tang LX, Lutje Spelberg JH, Fraaije MW, et al. Kinetic mechanism and enantioselectivity of halohydrin dehalogenase from. Biochemistry, 2003, 42(18): 5378–5386.

[18] de Jong RM, Tiesinga JJW, Rozeboom HJ, et al. Structure and mechanism of a bacterial haloalcohol dehalogenase: a new variation of the short-chain dehydrogenase_reductase fold without an NAD(P)H binding site. Embo J, 2003, 22(19): 4933–4944.

[19] Tang LX, Pazmino DET, Fraaije MW, et al. Improved catalytic properties of halohydrin dehalogenase by modification of the halide-binding site. Biochemistry, 2005, 44(17): 6609–6618.

[20] Fox RJ, Davis SC, Mundorff EC, et al. Improving catalytic function by ProSAR-driven enzyme evolution. Nat Biotechnol, 2007, 25(3): 338–344.

[21] Ma SK, Gruber J, Davis C, et al. A green-by-design biocatalytic process for atorvastatin intermediate. Green Chem, 2010, 12(1): 81–86.

[22] Patel JM. Biocatalytic synthesis of atorvastatin intermediates. J Mol Catal B Enzym, 2009, 61(3/4): 123–128.

[23] Xu Y, Kersten RD, Nam SJ, et al. Bacterial biosynthesis and maturation of the didemnin anti-cancer agents. J Am Chem Soc, 2012, 134(20): 8625–8632.

(本文責(zé)編陳宏宇)

Expression and characterization of a novel halohydrin dehalogenase fromKA081020-065

Lei Wang1,2, Jing Yuan2, Peiyuan Yao2, Lihua Cheng3, Meixian Xie3, Rongrong Jia3, Huijin Feng2, Min Wang1, Qiaqing Wu2, and Dunming Zhu2

1 Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China 2 Tianjin Engineering Center for Biocatalytic Technology, National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3 Hebei Chengxin Co., LTD, Shijiazhuang 051130, Hebei, China

Halohydrin dehalogenase is of great significance for biodegradation of the chlorinated pollutants, and also serves as an important biocatalyst in the synthesis of chiral pharmaceutical intermediates. A putative halohydrin dehalogenase () gene fromKA081020-065 was cloned and over-expressed inBL21 (DE3). The recombinant enzyme was purified by Ni-NTA column and characterized. Gel filtration and SDS-PAGE analysis showed that the native form of HheTM was a tetramer. It exhibited the highest activity at 50 °C. The nature and pH of the buffer had a great effect on its activity. The enzyme maintained high stability under the alkaline conditions and below 30 °C. HheTM catalyzed the transformation of ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate in the presence of cyanide, to give ethyl-4-cyano-3- hydroxybutyrate, a key intermediate for the synthesis of atorvastatin.

halohydrin dehalogenase,, ethyl-4-cyano-3-hydroxybutyrate

August 26, 2014; Accepted:November 14, 2014

Qiaqing Wu. Tel: +86-22-84861963; Fax: +86-22-84861996; E-mail: wu_qq@tib.cas.cn Dunming Zhu. Tel: +86-22-84861962; Fax: +86-22-84861996; E-mail: zhu_dm@tib.cas.cn

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