胸腺五肽和法氏囊活性五肽的融合表達(dá)及其對禽流感滅活疫苗的佐劑效應(yīng)

王臣，郭香玲，李小康，吳庭才，李德元，陳溥言

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胸腺五肽和法氏囊活性五肽的融合表達(dá)及其對禽流感滅活疫苗的佐劑效應(yīng)

王臣1，郭香玲1，李小康1，吳庭才1，李德元2，陳溥言2

1 河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)腫瘤免疫學(xué)重點實驗室，河南洛陽 471003 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物細(xì)菌學(xué)重點實驗室，江蘇南京 210095

王臣, 郭香玲, 李小康, 等. 胸腺五肽和法氏囊活性五肽的融合表達(dá)及其對禽流感滅活疫苗的佐劑效應(yīng). 生物工程學(xué)報, 2015, 31(5): 648–658.Wang C, Guo XL, Li XK, et al. Expression and adjuvant effects of the fusion peptide TBP5. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 648–658.

胸腺五肽 (Thymopentin，TP5) 和法氏囊活性五肽 (Bursopentin，BP5) 均具有重要的免疫學(xué)功能，但二者在基因水平上的聯(lián)合應(yīng)用尚未見報道。為研究TP5和BP5形成的重組融合肽TP5-BP5 (TBP5) 是否具有免疫佐劑活性，根據(jù)大腸桿菌偏嗜密碼子設(shè)計并合成重組融合肽TBP5編碼序列，將其克隆至pET-32a表達(dá)載體中，重組表達(dá)載體在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，并采用MTT法檢測其表達(dá)產(chǎn)物的體外活性。同時以TBP5聯(lián)合H9N2型禽流感病毒 (Avian influenza virus，AIV) 滅活疫苗免疫小鼠，檢測免疫后小鼠的HI抗體、HA抗體效價和細(xì)胞因子 (IL-4和IFN-γ) 的分泌水平，并通過動物免疫保護試驗來評價其對小鼠的免疫保護作用。結(jié)果顯示，TBP5在大腸桿菌中獲得表達(dá)；TBP5能顯著促進(jìn)小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞和脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖，并能增強機體免疫后HI抗體和HA抗體效價、提高細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平，表明TBP5既能增強機體體液免疫應(yīng)答，又能增強細(xì)胞免疫應(yīng)答。動物免疫保護試驗結(jié)果顯示TBP5有助于小鼠肺臟中H9N2型AIV病毒的清除。結(jié)果表明，重組融合肽TBP5具有良好的免疫佐劑的潛能，為進(jìn)一步研究開發(fā)新型疫苗佐劑奠定了基礎(chǔ)。

胸腺五肽，法氏囊活性五肽，融合表達(dá)，免疫佐劑

胸腺是機體免疫系統(tǒng)中重要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化成熟的場所，能分泌多種具有激素樣活性的多肽[1]。胸腺五肽 (Thymopentin，TP5)是胸腺生成素Ⅱ第32?36位氨基酸殘基片段，能誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，并促進(jìn)T細(xì)胞亞群的發(fā)育、分化[2]。作為一種免疫增強劑，TP5在臨床上主要用于自身免疫性疾病、慢性肝炎、免疫缺陷病、免疫功能低下、外科手術(shù)嚴(yán)重感染及腫瘤等的輔助治療[3]。法氏囊 (Bursa of fabricus，BF) 是禽類獨有的中樞體液免疫器官，相當(dāng)于哺乳動物的骨髓[4]。BF中存在許多生物活性物質(zhì)，尤其是一些具有免疫調(diào)節(jié)作用的小肽，能促進(jìn)禽類淋巴細(xì)胞的分化發(fā)育及免疫器官的成熟[5-9]。法氏囊活性五肽 (Bursopentin，BP5) 是從法氏囊中分離所得的一種新的活性小肽，氨基酸序列為CKDVY，能促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，提高機體體液和細(xì)胞免疫，還能平衡Th1和Th2類型的免疫反應(yīng)[10-11]，且這種免疫平衡作用是一般免疫增強劑所不具備的。雖然免疫活性因子TP5和BP5均能夠增強機體的免疫應(yīng)答，但TP5主要是誘導(dǎo)機體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，而BP5則主要調(diào)節(jié)機體的體液免疫應(yīng)答。近年來，有關(guān)TP5和BP5生物學(xué)功能的報道甚多，然而二者在基因水平上的聯(lián)合應(yīng)用目前未見報道，本研究根據(jù)大腸桿菌偏嗜密碼子設(shè)計并合成重組融合肽TP5-BP5 (TBP5) 編碼序列，構(gòu)建高效表達(dá)TBP5的基因工程菌株，在大腸桿菌中進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，并探討重組融合肽TBP5的免疫佐劑效應(yīng)，為新型疫苗佐劑的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及毒株

TBP5基因及上下游引物，均由華大基因科技股份有限公司化學(xué)合成；表達(dá)載體pET-32a (+)、DH5α菌株、BL21 (DE3) 菌株均為河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院本實驗室所保存。禽流感疫苗 (H9N2亞型，SDS696株) 購自乾元浩生物股份有限公司；H9N2亞型禽流感病毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05 (H9N2) 和pET32a-HA (H9N2) 質(zhì)粒，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭其升博士惠贈。

1.2 主要試劑及工具酶

DTT、ConA、溴酚藍(lán)、瓊脂糖、考馬斯亮藍(lán)R-250、淋巴細(xì)胞分離液、MTT、胎牛血清 (FBS) 均購自鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司；100 bp DNA marker、PageRuler Plus Prestained Protein Ladder、IPTG、dNTPs、Nucleic acid strain (核酸染料)、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、Trizol試劑、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體、TMB底物顯色液均購自鄭州鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；小鼠細(xì)胞因子含量測定ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶R I、I、d Ⅲ，T4 DNA連接酶、酶均購自TaKaRa公司；Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG，購自Invitrogen公司。TP5和BP5標(biāo)準(zhǔn)品均由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?。

1.3 實驗動物

90只BALB/c小鼠(4?6周齡，20±2 g)，購自河南省實驗動物研究中心。

1.4 重組融合肽TBP5的克隆與表達(dá)

根據(jù)大腸桿菌的偏嗜密碼子設(shè)計重組融合肽TBP5串聯(lián)融合基因，并針對該融合肽基因設(shè)計引物F1、F2和F3 (表1)，分別在F1加上RⅠ酶切位點、F3中加上終止密碼子和Ⅰ酶切位點，然后通過柔性Linker (G-G-G-G-S) 基因?qū)P5和BP5基因串聯(lián)形成重組融合肽TBP5基因 (圖1)。利用F1、F2和F3引物進(jìn)行重疊PCR方法 (SOE-PCR) 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并回收重組融合肽TBP5基因。TBP5基因片段和質(zhì)粒載體pET-32a均用RⅠ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切后再回收，并用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。利用質(zhì)粒快速提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pET32a-TBP5，用d Ⅲ進(jìn)行缺失酶鑒定，并送往華大基因科技股份有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pET32a-TBP5轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE分析其表達(dá)情況。

表1 引物序列

The restriction enzyme sites are marked with underlined.

圖1 重組融合肽TBP5的設(shè)計圖

1.5 重組融合肽TBP5的體外活性測定

無菌采取4?6周齡BALB/c小鼠 (20±2) g的胸腺、脾臟，將其置于200目不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上用注射器針芯輕輕研壓制成細(xì)胞懸液，加入Hank’s液中，500 r/min離心5 min，除去紅細(xì)胞；取上清500 r/min離心5 min，棄上清，以Hank’s液洗滌沉淀2次；用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基將兩種淋巴細(xì)胞密度均調(diào)整為約5×106cells/mL。其中胸腺淋巴細(xì)胞加入ConA至終濃度為5 μg/mL，脾臟淋巴細(xì)胞加入PMA至終濃度為300 ng/mL，分別分裝到96孔板中，100 μL/孔，并設(shè)3個復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)6 h；將不同濃度 (0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg/mL) 的重組融合肽TBP5 (經(jīng)蛋白質(zhì)Ni柱親和層析純化) 加入淋巴細(xì)胞中，100 μL/孔，并設(shè)對照組(PBS、1.0 μg/mL大腸桿菌硫氧還蛋白 (Thioredoxin，TRX)、1.0 μg/mL TP5、1.0 μg/mL BP5)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，標(biāo)準(zhǔn)MTT法檢測重組融合肽TBP5對胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。相對細(xì)胞增殖率 (%) = (實驗組570/對照組570) ×100%。

1.6 動物的分組與免疫

將90只4?6周齡BALB/c小鼠隨機分為5組，每組18只，第1組作空白對照組 (100 μL PBS)；第2?5組分別為禽流感滅活疫苗組 (H9N2亞型SDS696株，107TCID50/0.1 mL)、H9N2 AIV滅活疫苗 (107TCID50/0.1 mL) +TP5組 (10 μg)、H9N2 AIV滅活疫苗 (107TCID50/0.1 mL) +BP5組(10 μg)、H9N2 AIV滅活疫苗 (107TCID50/0.1 mL)+重組融合肽TBP5組 (10 μg)。采取肌肉注射 (i.m.) 方式進(jìn)行兩次免疫，每次免疫間隔2周，即所有組分別于0、14 d進(jìn)行首免和二免。

1.7 血清中HI抗體效價的測定

首免后0、7、14、21 d，從免疫小鼠中每組隨機抽取5只小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢取血，并分離血清，56 ℃滅活30 min，采用標(biāo)準(zhǔn)HI試驗檢測小鼠血清中HI抗體效價[12]。檢測H9N2型禽流感病毒 (A/chicken/Jiangsu/NJ07/05) 的血凝效價，并將其配制成4單位H9N2型AIV抗原。用PBS進(jìn)行系列倍比稀釋后加入96孔微量板中，每孔加50 μL 4單位H9N2型AIV抗原，輕輕混勻，室溫下孵育1 h后，每孔加入50 μL 0.5%雞紅細(xì)胞懸液，室溫下靜置1 h，觀察各組血凝情況，以可抑制血凝的最高血清稀釋度為待檢血清中HI抗體效價。

1.8 血清中HA抗體的測定

于首免后7、21 d分離小鼠血清，并采用ELISA方法檢測小鼠血清中的H9N2 HA抗體[11,13]。以10 μg/mL在大腸桿菌中表達(dá)的重組H9N2 HA蛋白[14]包被96孔微量板，4 ℃過夜，次日棄孔內(nèi)液，用PBS/0.1% Tween-20 (PBST) 洗板3次 (每次靜置3 min)，以1% BSA于37 ℃封閉2 h，棄孔內(nèi)液，用PBST洗板3次。用含1% BSA的PBS將小鼠血清稀釋為1∶101?1∶105，第1孔作為空白對照，第2孔加100 μL PBS，第3孔開始加1：20稀釋的小鼠血清100 μL，于37 ℃放置2 h，棄孔內(nèi)液，PBST洗板3次，除第1孔外，每孔加1：2 000稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體100 μL，37 ℃孵育1 h，棄孔內(nèi)液，PBST洗板3次，除第1孔外，每孔加100 μL TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)20 min，每孔加100 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測450。

1.9 血清中IL-4和IFN-γ的測定

于首免后7、21 d分離小鼠血清，采用小鼠細(xì)胞因子含量測定ELISA試劑盒檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。每次分析時，使用對照的重組細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算血清中細(xì)胞因子的含量。

1.10 動物免疫保護試驗

二免2周后 (即首免后28 d)，經(jīng)滴鼻途徑對各實驗組小鼠 (18只/組) 攻擊H9N2型禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05 (H9N2) 100 μL (2.5×106TCID50/0.1 mL)，設(shè)PBS對照組，攻毒后各組小鼠隔離飼養(yǎng)。于攻毒后3、5、7 d分別從各組隨機抽取5只小鼠分離其肺臟，應(yīng)用SYBR Green熒光定量PCR方法采用Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG檢測各小鼠肺臟中病毒的滴度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)H9N2型禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05 (H9N2) 的基因序列 (GenBank Accession No. AY364228) 設(shè)計引物，引物序列為HA-F：5?-CTACTGTTGGGAG GAAGAGAATGGT-3?；HA-R：5?-TGGGCGTCTT GAATAGGGTAA-3?。

1.11 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 重組融合肽TBP5的表達(dá)

用引物F1、F2和F3對融合肽TBP5的基因進(jìn)行SOE-PCR擴增，經(jīng)雙酶切、連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒并用d Ⅲ進(jìn)行缺失酶鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒沒有被d Ⅲ切出相應(yīng)條帶 (圖2A)，表明重組質(zhì)粒已經(jīng)缺失d Ⅲ酶切位點。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，重組融合肽TBP5基因全部插入pET-32a載體中，且TBP5基因與設(shè)計完全相符，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，將重組質(zhì)粒命名為pET32a-TBP5。將重組質(zhì)粒pET32a-TBP5轉(zhuǎn)入BL21 (DE3) 中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析后，可見重組表達(dá)載體pET32a-TBP5誘導(dǎo)后表達(dá)約27.0 kDa大小的目的蛋白條帶，純化后條帶更為清晰，與預(yù)期分子量大小一致，表明重組融合肽TBP5基因在大腸桿菌中獲得了表達(dá) (圖2B)。

圖2 重組質(zhì)粒pET32a-TBP5的鑒定及重組融合肽TBP5在大腸桿菌中的表達(dá)

2.2 重組融合肽TBP5的體外活性

將TBP5重組菌的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)蛋白質(zhì)Ni柱親和層析純化和分光光度計定量后，通過MTT法測定重組融合肽TBP5對小鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與PBS組相比，不同濃度 (0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg/mL) 的TBP5均可促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖。與TP5、BP5相比，TBP5刺激胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性更強，且其濃度為0.4、0.8、6.4 μg/mL時差異顯著 (<0.05)，濃度為1.6 μg/mL和3.2 μg/mL時差異極顯著 (<0.01) (圖3A和3B)。表明重組融合肽TBP5能夠促進(jìn)小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞和脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖。

2.3 免疫小鼠血清中的HI抗體效價

分別于首免后0、7、14、21 d采集各組小鼠血清進(jìn)行HI抗體檢測，如圖4所示，除PBS對照組外，各免疫組小鼠首免后7 d均可檢測到HI抗體，且首免后14、21 d時各免疫組小鼠HI抗體效價均顯著上升，但HI抗體效價存在組間差異。結(jié)果顯示，首免后7、14、21 d時，疫苗+BP5組和疫苗+TP5組小鼠血清中HI抗體效價均高于單獨疫苗組，且疫苗+BP5組HI抗體效價高于疫苗+TP5組，但差異并不顯著 (>0.05)，而疫苗+TBP5組小鼠血清中HI抗體效價則顯著高于疫苗+BP5組 (<0.05)。表明重組融合肽TBP5能夠顯著增強免疫后小鼠的HI抗體水平。

2.4 血清中抗體HA效價

于首免后7、21 d分離小鼠血清進(jìn)行HA抗體檢測，結(jié)果如圖5所示，首免后7 d和21 d時，疫苗+BP5組和疫苗+TP5組小鼠血清中HA抗體效價均顯著高于單獨疫苗組 (<0.05)，且疫苗+BP5組HA抗體效價稍高于疫苗+TP5組，而疫苗+TBP5組小鼠的HA抗體效價則顯著高于疫苗+BP5組 (<0.05)，且首免后21 d時較首免后7 d時各組HA抗體水平均進(jìn)一步提高。表明重組融合肽TBP5顯著提高免疫H9N2型AIV疫苗后小鼠的HA抗體分泌水平。

圖3 重組融合肽TBP5對小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

圖4 血清中抗體HI效價檢測

2.5 免疫小鼠血清中IL-4和IFN-γ水平

于首免后7、21 d分離小鼠血清，采用小鼠細(xì)胞因子含量測定ELISA試劑盒檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量，以分析TBP5對H9N2型AIV疫苗免疫后小鼠的細(xì)胞免疫水平的影響。從圖6可以看出，首免后7 d和21 d時，單獨疫苗組的IL-4和IFN-γ的分泌量均高于PBS組；疫苗+TP5組和疫苗+BP5組的IL-4和IFN-γ的分泌量與單獨疫苗組相比均顯著升高 (<0.05)，且疫苗+TP5組IL-4和IFN-γ的分泌量略高于疫苗+BP5組；而疫苗+TBP5組IL-4和IFN-γ的分泌量顯著高于疫苗+TP5組 (<0.05)。表明重組融合肽TBP5能夠提高免疫后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平。

2.6 免疫小鼠的免疫保護試驗

由于H9N2型禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05 (H9N2) 不能使小鼠出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和導(dǎo)致死亡，為有效評價各實驗組小鼠免疫保護力的差異，于二免2周后，對小鼠攻擊A/chicken/Jiangsu/NJ07/05 (H9N2) 100 μL (2.5×106TCID50/0.1 mL)，同時設(shè)PBS對照組，在攻毒后3、5、7 d從各組隨機抽取5只小鼠采集其肺臟，采用SYBR Green熒光定量PCR方法檢測肺臟中病毒滴度。結(jié)果顯示(圖7)，攻毒后3、5、7 d，疫苗+TP5組和疫苗+BP5組小鼠肺臟中病毒滴度均顯著低于單獨疫苗組 (<0.05)，而疫苗+TBP5組病毒滴度與疫苗+TP5組和疫苗+BP5組相比顯著下降 (<0.05)，且攻毒后7 d時各實驗組小鼠肺臟中病毒滴度明顯低于攻毒后3 d和5 d時病毒滴度 (<0.05)，其中疫苗+TBP5組在攻毒后7 d時幾乎檢測不到小鼠肺臟中的病毒粒子。表明重組融合肽TBP5能夠有效抑制H9N2型AIV在小鼠肺臟中的復(fù)制，促進(jìn)小鼠肺臟中病毒的清除，從而對小鼠起到免疫保護的效果。

圖6 血清中IL-4和IFN-γ的分泌量

圖7 小鼠肺臟中AIV病毒滴度

3 討論

疫苗對控制人類和動物傳染性疾病的流行具有至關(guān)重要的作用，而合適的佐劑則能增強疫苗的免疫原性、提高機體免疫應(yīng)答水平，使疫苗更有效地發(fā)揮免疫保護作用[15-16]。然而，大多數(shù)與抗原聯(lián)合使用的佐劑有諸多副作用，只有很少一部分在臨床上得以應(yīng)用。因此，新型疫苗佐劑的開發(fā)亟待研究。近年來，大量的研究證實多肽具有免疫佐劑活性，如胸腺素Tα1、囊素BS、囊素樣肽BLP等[13,17-18]。然而多肽免疫佐劑在臨床應(yīng)用中也存在一些問題：生物活性肽大多是小分子蛋白，分子量小，在生物體內(nèi)半衰期很短，導(dǎo)致對機體產(chǎn)生的免疫期較短；另外，雖然臨床上一些多肽聯(lián)合使用時效果很好，但多肽的生產(chǎn)成本極高，極大地制約了多肽免疫佐劑在臨床上的應(yīng)用。通過基因工程技術(shù)將兩種多肽連接制備重組融合肽既可以提高多肽的半衰期，延長免疫期，同時融合肽理論上具有兩種多肽的活性，這樣可降低多肽免疫佐劑的生產(chǎn)成本。

胸腺五肽TP5具有與胸腺生成素II相似的生物學(xué)活性，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞分化、增殖和成熟，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)育并活化，雙向調(diào)節(jié)失衡的免疫系統(tǒng)[2]，而且還具有抗腫瘤和抗氧化功能[19]，因而在臨床上得以廣泛應(yīng)用。法氏囊活性五肽BP5是從雞法氏囊中分離獲得的一種新的免疫活性肽，能夠調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有免疫佐劑的潛能。由于TP5和BP5均可增強機體的免疫應(yīng)答，表現(xiàn)出免疫佐劑活性，然而二者融合而形成的重組融合肽TBP5是否也具有免疫增強作用呢？針對這一設(shè)想，本研究根據(jù)大腸桿菌偏嗜密碼子在TP5和BP5之間設(shè)計一段Linker (G-G-G-G-S) 通過SOE-PCR方法合成了重組融合肽TP5-BP5 (TBP5) 基因，并將其克隆至pET32a表達(dá)載體中，成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET32a-TBP5，對誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，重組融合肽TBP5表達(dá)產(chǎn)物分子量大小約為27.0 kDa，與預(yù)期的分子量大小一致，表明重組融合肽TBP5基因在BL21中獲得表達(dá)。

為檢測原核表達(dá)的重組融合肽TBP5是否具有體外免疫活性，本試驗以不同濃度(0.2?6.4 μg/mL) 的TBP5刺激小鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞，試驗結(jié)果顯示，TBP5能夠顯著促進(jìn)小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞和脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖，表明TBP5具有較強的體外免疫活性。為進(jìn)一步探討重組融合肽TBP5的免疫佐劑特性，以TBP5聯(lián)合H9N2型AIV滅活疫苗免疫小鼠，檢測免疫后小鼠血清中HI抗體、HA抗體水平及細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ的分泌情況，結(jié)果顯示，疫苗+TBP5組免疫后小鼠的HI抗體效價和HA抗體分泌水平顯著高于疫苗+BP5組 (<0.05)，疫苗+TBP5組免疫后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平顯著高于疫苗+TP5組，表明重組融合肽TBP5既可提高H9N2型AIV疫苗免疫后機體的體液免疫水平，又可提高機體的細(xì)胞免疫水平。

為進(jìn)一步分析重組融合肽TBP5對動物攻毒后的免疫保護性作用，本研究在二免2周后對小鼠進(jìn)行動物免疫保護試驗。由于本試驗選用的H9N2亞型禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05 (H9N2) 不能使小鼠出現(xiàn)明顯的流感臨床癥狀和導(dǎo)致死亡，而且，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)以2.5×106TCID50的劑量感染小鼠后該病毒主要分布在其肝臟、脾臟和肺臟，其中肺臟中的帶毒量最多。因此，為有效評價TBP5誘導(dǎo)的免疫保護作用，本研究采用熒光定量PCR方法檢測不同免疫組小鼠肺臟中病毒拷貝數(shù)來分析TBP5對小鼠的免疫保護效果[20-21]，結(jié)果顯示攻毒后3 d TBP5明顯有助于小鼠肺臟中病毒的清除，攻毒后7 d時疫苗+TBP5組幾乎檢測不到小鼠肺臟中的病毒粒子。表明重組融合肽TBP5能夠有效抑制H9N2型AIV在小鼠肺臟中的復(fù)制，促進(jìn)小鼠肺臟中病毒的清除，結(jié)果進(jìn)一步提示，TBP5可能通過介導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)發(fā)揮免疫保護作用。

總之，本研究成功構(gòu)建了重組融合肽TP5-BP5 (TBP5) 基因工程菌株，并在大腸桿菌中獲得了表達(dá)；重組的融合肽TBP5能顯著促進(jìn)小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞和脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖，有效提高機體體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，動物免疫保護試驗結(jié)果顯示TBP5有助于小鼠肺臟中H9N2型AIV病毒的清除。本研究提示，重組融合肽TBP5具有良好的免疫佐劑潛能，為進(jìn)一步開發(fā)新型疫苗佐劑奠定了基礎(chǔ)。

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該結(jié)論看起來似乎是正確的，但仔細(xì)分析，就會發(fā)現(xiàn)有以下矛盾：其一，安培力的效果是改變或維持導(dǎo)體的運動狀態(tài)，而洛倫茲力的效果是為粒子做勻速圓周運動提供向心力。其二，安培力做功，而洛倫茲力不做功。綜上所述，可以認(rèn)為安培力不是洛倫茲力的宏觀表現(xiàn)。既不符合力的矢量性原則，也不符合功的基本原理，即二者雖然數(shù)量上相關(guān)，但機理上則有所不同，現(xiàn)從不同角度分析安培力與洛倫茲力的關(guān)系。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Expression and adjuvant effects of the fusion peptide TBP5

Chen Wang1, Xiangling Guo1, Xiaokang Li1, Tingcai Wu1, Deyuan Li2, and Puyan Chen2

1,,,471003,,2’,,,210095,,

Thymopentin (TP5) and bursopentin (BP5) are both immunopotentiators. To explore whether the TP5-BP5 fusion peptide (TBP5) has adjuvant activity or not, we cloned the TBP5 gene and confirmed that the TBP5 gene in a recombinant prokaryotic expression plasmid was successfully expressed inBL21. TBP5 significantly promoted the proliferation of thymic and splenic lymphocytes of mice. The potential adjuvant activity of the TBP5 was examined in mice by coinjecting TBP5 and H9N2 avian influenza virus (AIV) inactivated vaccine. HI antibody titers, HA antibodies and cytokines levels (IL-4 and IFN-γ) were determined. We found that TBP5 markedly elevated serum HI titers and HA antibody levels, induced the secretion of both IL-4 and IFN-γ cytokines. Furthermore, virus challenge experiments confirmed that TBP5 contributed to inhibition replication of the virus [H9N2 AIV (A/chicken/Jiangsu/NJ07/05)] from mouse lungs. Altogether, these findings suggest that TBP5 may be an effective adjuvant for avian vaccine and that this study provides a reference for further research on new vaccine adjuvants.

thymopentin, bursopentin, fusion expression, adjuvant

September 28, 2014; Accepted: December 8, 2014

Chen Wang. Tel: +86-379-65507210; Fax: +86-379-64282341; E-mail: wangchen2001@126.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31101792, 31201928), Foundation for University Key Teacher by Higher Education of Henan Province (No. 2012GGJS-077).

國家自然科學(xué)基金(Nos. 31101792, 31201928)，河南省高校青年骨干教師項目(No. 2012GGJS-077) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-02-03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150203.1610.001.html