液相質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組方法優(yōu)化及其在藍(lán)細(xì)菌分析中的應(yīng)用

牛向鳳，張曉清，于馨恒，蘇營(yíng)雪，陳磊，張衛(wèi)文

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液相質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組方法優(yōu)化及其在藍(lán)細(xì)菌分析中的應(yīng)用

牛向鳳，張曉清，于馨恒，蘇營(yíng)雪，陳磊，張衛(wèi)文

天津大學(xué)化工學(xué)院合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072

牛向鳳, 張曉清, 于馨恒, 等. 液相質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組方法優(yōu)化及其在藍(lán)細(xì)菌分析中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(4): 577–590.Niu XF, Zhang XQ, Yu XH, et al. Optimization and application of targeted LC-MS metabolomic analyses in photosynthetic cyanobacteria. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 577–590.

為了準(zhǔn)確鑒定光合藍(lán)細(xì)菌中的各種代謝物，需要對(duì)基于液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀 (LC-MS) 的代謝組學(xué)分析方法進(jìn)行有針對(duì)性的優(yōu)化。本研究選取了24種涉及中心碳代謝和能量代謝的代謝物作為L(zhǎng)C-MS的檢測(cè)目標(biāo)，獲得了每個(gè)代謝物的最適色譜分離條件和質(zhì)譜參數(shù)；同時(shí)以光合藍(lán)細(xì)菌sp. PCC6803為主要對(duì)象，針對(duì)性地優(yōu)化了樣品前處理?xiàng)l件，結(jié)果顯示適當(dāng)延長(zhǎng)梯度洗脫順序表的時(shí)間并將流速設(shè)為0.2 mL/min可以得到最佳的分離效果，同時(shí)選擇80% () 甲醇 (?80 ?C) 作為代謝物萃取劑。分析結(jié)果證明這一代謝組分析技術(shù)可以成功地應(yīng)用到光合藍(lán)細(xì)菌的研究中。

LC-MS，代謝物，代謝組學(xué)，藍(lán)細(xì)菌

光合微生物能夠利用太陽(yáng)能固定大氣中的CO2，這對(duì)于減緩和扭轉(zhuǎn)全球變暖的趨勢(shì)有著重要意義。同時(shí)因其高效的光合作用[1-3]、較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力[4]、簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)和遺傳背景[5]，光合微生物在生物工程中的應(yīng)用近年來(lái)備受關(guān)注。首先，光合微生物自身能夠產(chǎn)生多種化學(xué)品，例如油脂[6]、糖類[7]等；其次，利用基因工程技術(shù)改造后的光合微生物可以成為工業(yè)中生產(chǎn)重要化合物的非常有潛力的工程宿主菌。例如已有研究者將光合微生物投入到生物工程應(yīng)用中，實(shí)現(xiàn)了在光合微生物中生物燃料和精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)，如乙醇[8]、正丁醇[9]、異丁醇[10]、脂肪酸[6]、糖類[7]、氫[11]等。為了進(jìn)一步提高對(duì)自然環(huán)境中光合微生物的了解，發(fā)掘光合微生物在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，需要開(kāi)發(fā)高效靈敏的分析技術(shù)對(duì)它們的代謝機(jī)制進(jìn)行探究。

代謝組學(xué)作為一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)小分子的多樣性和豐度差異的分析方法，是對(duì)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究的重要補(bǔ)充[12-18]。質(zhì)譜分析技術(shù)因其很高的靈敏度和廣泛適用性已成為代謝組學(xué)中的主要分析技術(shù)，它和不同分離技術(shù)的耦合，如氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 和液相色譜?質(zhì)譜 (LC-MS)，也已成為了研究細(xì)胞代謝組的理想工具[19]。其中，GC-MS方法盡管有較高的色譜分辨率、高重現(xiàn)性及靈敏性[20]，但由于許多關(guān)鍵化合物因?yàn)椴荒鼙粴饣螂x子化而無(wú)法被檢測(cè)，有一定的使用局限性[12]。而與此同時(shí)，LC-MS方法因其高通量和軟電離技術(shù) (例如ESI和APCI)，針對(duì)一些化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的代謝物，例如在中心碳代謝途徑和能量代謝途徑中有著重要作用的化合物 (NADP (H)) 和NAD (H) 或者一些易水解的核苷酸類化合物 (ATP、GTP、cAMP和PEP)，能夠得到更好的結(jié)果，可以彌補(bǔ)GC-MS的一些應(yīng)用上的不足。通?；贕C-MS的代謝組分析都是以全掃描的方式獲得生物代謝所反映的全部信息，而基于LC-MS的代謝組分析可以利用儀器的選擇離子監(jiān)測(cè)方式對(duì)一些特定的化合物進(jìn)行定量分析，這種做法可以降低信噪比并能對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)中重要的代謝物進(jìn)行選擇性檢測(cè)，提高了檢測(cè)的靈敏性[21-22]。

目前已有研究利用LC-MS的分析方法對(duì)藍(lán)細(xì)菌中的模式生物如sp. PCC 7002中的特定代謝物進(jìn)行分析[13,23]。然而由于很多目標(biāo)代謝物在水溶液或細(xì)胞內(nèi)易被水解，要獲得準(zhǔn)確反映生物信息的代謝物組，還需要優(yōu)化LC-MS代謝組分析方法中的各個(gè)步驟，如樣品前處理、代謝物的萃取、色譜分離以及質(zhì)譜參數(shù)等。其中，樣品前處理和萃取劑是獲取完整代謝物組信息的關(guān)鍵因素，有研究估計(jì)樣品前處理中造成的誤差占整個(gè)測(cè)量誤差的60%?80%[24]。和常規(guī)的異養(yǎng)菌相比，光合藍(lán)細(xì)菌在面對(duì)環(huán)境條件如光照強(qiáng)度的變化時(shí)會(huì)發(fā)生代謝的迅速改變[25]，因此對(duì)其代謝組樣品的制備要求更高。目前針對(duì)光合藍(lán)細(xì)菌的完整LC-MS代謝組分析方法不多，對(duì)方法的系統(tǒng)優(yōu)化也還未見(jiàn)于文獻(xiàn)。

本研究以光合藍(lán)細(xì)菌模式菌sp. PCC 6803為對(duì)象，對(duì)其代謝物組樣品的制備和基于LC-MS的代謝組學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，證明了該方法能夠運(yùn)用于光合藍(lán)細(xì)菌的代謝組研究中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)使用的菌株為sp. PCC 6803。

1.1.2 試劑

HPLC重蒸水，色譜級(jí)別甲醇，三丁胺、乙酸以及24種代謝物標(biāo)品 (圖1) 均購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀 (Agilent 6410，美國(guó))、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf 5430R，德國(guó))、超低溫冰箱 (ThermoForma 700 series，美國(guó))、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (島津UV?1750，日本)。

1.1.4 培養(yǎng)基

培養(yǎng)sp. PCC6803所用培養(yǎng)基為pH 7.5的BG?11培養(yǎng)基，成分包括：1.5 g/L NaNO3，0.04 g/L K3HPO4·3H2O，0.075 g/L MgSO4·7H2O，0.006 g/L檸檬酸 (Citric acid (C6H8O7))，0.006 g/L檸檬酸鐵銨 (Ammonium ferric citrate ((NH4)3Fe(C6H5O7)2))，0.036 g/L CaCl2·2H2O，0.001 g/L EDTA，0.02 g/L NaCO3，2.86 mg/L H3BO3，1.81 mg/L MnCl2·4H2O，0.222 mg/L ZnSO4·7H2O，0.390 mg/L NaMoO4·5H2O，0.079 mg/L CuSO4·5H2O， 0.049 4 mg/L Co(NO3)2·6H2O，并用稀鹽酸將pH調(diào)至7.5。

1.1.5 培養(yǎng)條件

sp. PCC 6803在裝有50 mL BG?11液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)。將搖瓶放置在光照搖床中，光照強(qiáng)度約為50 μmol photons/(m2·s)，轉(zhuǎn)速130 r/min，溫度控制在 30 ?C[26?28]。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備方法

取藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)樣品后在常溫下離心 (8 000×) 8 min，棄上清后立即加入900 μL 80% () 甲醇/水溶液 (?80 ?C) 并在液氮中反復(fù)凍融3次。將凍融后的混合液離心 (?4 ?C, 15 000×) 5 min，收集上清液并在沉淀物里加入500 μL 80% () 甲醇/水溶液 (?80 ?C)，重復(fù)之前步驟，最后合并兩次上清并存于?80 ?C，以備LC-MS分析。

圖1 化合物的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果及其在代謝途徑中的分布 (用粗體表示的為本研究中所選擇分析的代謝物，代謝途徑參照文獻(xiàn)[13]和[25]；1最強(qiáng)準(zhǔn)分子離子的碎裂電壓值；2最強(qiáng)準(zhǔn)分子離子的碰撞池電壓值)

1.2.2 LC-MS代謝物檢測(cè)方法

色譜條件為：液相色譜儀器為Agilent 1260系列，色譜柱為SYnergi Hydro?RP (C18, 150 mm×2.0 mm I.D., 4 μm 80 ? particles, Phenomenex, Torrance, CA, USA)；柱溫箱溫度為40 ?C；洗脫方式為梯度洗脫，流動(dòng)相A為10 mmol/L三丁胺溶液 (pH 4.95)，流動(dòng)相B為甲醇，洗脫時(shí)間表為0 min (0% B)，8 min (35% B)，18 min (35% B)，24 min (90% B)，28 min (90% B)，30 min (50% B)，31 min (0% B)；流速為0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀為Agilent 6410 Triple Quadrupole Mass Analyser，離子源為ESI；進(jìn)樣量為10 μL；毛細(xì)管電壓為4 000 V；載氣流速和壓力分別為10 L/min和50 psi，溫度為300 ?C。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

實(shí)驗(yàn)中涉及優(yōu)化數(shù)據(jù)以及樣品分析結(jié)果都是在負(fù)離子模式下用多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (Multiple reaction monitoring，MRM) 掃描得到的。選取了24個(gè)涉及中心碳代謝和能量代謝的代謝物 (圖1[13,25]) 進(jìn)行分析和方法優(yōu)化，其標(biāo)準(zhǔn)品混合液的濃度為50 μmol/L。數(shù)據(jù)采集軟件為Agilent Mass Hunter workstation LC/QQQ acquisition software (Version B.04.01)，數(shù)據(jù)分析軟件為Agilent Qualitative Analysis software (Version B.04.00)。每種代謝物的相對(duì)定量是由MRM模式下色譜峰的峰面積決定的，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，將樣品的代謝組數(shù)據(jù)輸入軟件SIMCA?P 11.5進(jìn)行主成分 (PCA) 分析[29]。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS檢測(cè)代謝物方法的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

基于LC-MS的代謝組學(xué)分析方法，限制步驟在于色譜分離而非質(zhì)譜檢測(cè)。全掃描的分析方式，即想要獲得生物代謝的全部信息時(shí)，采用較長(zhǎng)的分離時(shí)間確實(shí)能夠檢測(cè)到更多的化合物，有時(shí)分離時(shí)間可以長(zhǎng)達(dá)1 h[12]，但對(duì)于檢測(cè)特定化合物的代謝組分析，在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)獲得需要分離的代謝物信息即可。本實(shí)驗(yàn)以24種代謝物的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品為分析對(duì)象，從流速和梯度洗脫的洗脫順序表兩方面進(jìn)行了優(yōu)化。其中24種重要代謝物及其在代謝途徑中的分布見(jiàn)圖1。

1) 洗脫順序表的優(yōu)化: 本研究選取24種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品中的15種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品為分析對(duì)象，在文獻(xiàn)報(bào)道的總時(shí)間為18 min的順序表[13]基礎(chǔ)上，同時(shí)在不改變流動(dòng)相比例的前提下，分別嘗試了總時(shí)長(zhǎng)為26、31、36以及51 min的洗脫時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫時(shí)間為18和26 min時(shí)，分離效果不好；當(dāng)洗脫時(shí)間延長(zhǎng)到31 min以上時(shí)，分離效果明顯改善；但介于31、36和51 min，分離效果差別不大。下圖顯示了3種總時(shí)間為18 min、31 min和51 min的不同洗脫順序表 (分別命名為順序表TT1、TT2和TT3) 下得到的EIC圖 (選擇離子流圖，Elect Ion Current) (流速為0.3 mL/min)。圖2A?C所示結(jié)果顯示 15 min后的一些化合物在分離上呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，其中TT1中15.8 min處的一個(gè)峰在TT2中分裂成兩個(gè)峰，其中包含了4種化合物：ADP、NADH、NADP和PEP。而且TT1中16.5 min左右緊密相鄰的兩個(gè)峰包含3種化合物：ATP、NADPH和AcCOA，在TT2的EIC圖中在24 min到26 min期間出峰。而在TT3中，51 min的長(zhǎng)時(shí)間下分離效果沒(méi)有比洗脫時(shí)間為31 min時(shí)的分離效果有所提高，因此我們選擇了分離效果相當(dāng)且時(shí)間相對(duì)較短的方法，即認(rèn)為31 min為最佳的洗脫時(shí)間。

2) 流速的優(yōu)化: 在以上洗脫順序表的基礎(chǔ)上，以24種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品為研究對(duì)象，本實(shí)驗(yàn)比較了3個(gè)流速下的EIC圖，流速分別為 0.15 mL/min、0.20 mL/min和0.3 mL/min (圖3A?C)。當(dāng)流速為0.15 mL/min時(shí)，化合物之間可以互相分離，但除了GLU外，其他化合物均在13 min后才出峰，并且27 min以后的7個(gè)化合物緊密相連，這就需要再延長(zhǎng)洗脫順序表以得到更好的分離效果 (圖3A)。而提高流速到0.30 mL/min時(shí)，在總時(shí)間為31 min的洗脫中各化合物均能被檢測(cè)到，但3PG被包含在15.5 min的峰中，NADH和PEP這兩個(gè)化合物也緊密相連 (圖3C)。在0.20 mL/min的流速下，3PG、FBP均以單峰的形式分離出來(lái)，而且NADH和PEP也分離開(kāi)，NADP也以一個(gè)肩縫的形式被分離出來(lái)，而且總時(shí)間為31 min的洗脫順序表也適用 (圖3B)。因此0.2 mL/min成為了最適分離流速。

圖2 三種梯度洗脫時(shí)間順序表的比較 (TT1、TT2、TT3分別為18 min、31 min、51 min的洗脫時(shí)間。MPB為流動(dòng)相B (甲醇)；各化合物縮寫(xiě)見(jiàn)Abbreviations；EIC:選擇離子流圖)

圖3 不同流速間的比較 (不同流速下獲得的EIC圖 (選擇離子流圖)：(A) 0.15 mL/min、(B) 0.20 mL/min、(C) 0.30 mL/min。具體流速和各化合物的標(biāo)注見(jiàn)圖中。各化合物的縮寫(xiě)見(jiàn)Abbreviations)

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

本研究采用MRM的掃描方式精確鑒定了24個(gè)與中心碳代謝及能量代謝緊密相關(guān)的化合物，建立了自己的數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)其質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化是利用Agilent optimizer software，在各化合物的準(zhǔn)分子離子[M?H]?質(zhì)量數(shù)以及特征碎片離子 (Product ion) 質(zhì)量數(shù)已知的情況下，設(shè)置Fragmentation voltage (FV) 值和Collision voltage (CV) 值的區(qū)間[13]和步長(zhǎng)，由Agilent optimizer software軟件即可自動(dòng)得到最適的FV值和CV值。各個(gè)化合物的優(yōu)化結(jié)果顯示于 圖1中。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

通過(guò)細(xì)胞淬滅可以迅速終止胞內(nèi)的代謝活動(dòng)，獲得準(zhǔn)確反映細(xì)胞瞬時(shí)生理狀態(tài)的代謝物濃度信息。萃取劑可以破壞細(xì)胞壁，使胞內(nèi)代謝物釋放，同時(shí)溶解化合物。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)所選的24種與中心碳代謝和能量代謝相關(guān)的化合物來(lái)說(shuō)，使用已有報(bào)道甲醇水的萃取劑能夠獲得sp. PCC 6803的代謝物組。事實(shí)上，在sp. PCC 6803的早期代謝組學(xué)研究中，有人提出過(guò)使用100%冷甲醇作為萃取劑[30-31]，也有人提出過(guò)使用80% () 甲醇/水溶液作為萃取劑[13,25]。此外，在針對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的代謝組學(xué)分析的早期研究發(fā)現(xiàn)，直接使用不經(jīng)過(guò)離心收集的微生物培養(yǎng)物和萃取劑 (100%甲醇) 按1：4的比例混合離心提取代謝物能夠獲得較好的分析結(jié)果，這樣做的優(yōu)勢(shì)是能夠減少在樣品離心收集過(guò)程中可能造成的代謝物變化[32]。本研究中我們首先對(duì)比了不經(jīng)過(guò)離心收集的sp. PCC 6803培養(yǎng)物與萃取 (100%甲醇) 按1∶4的比例直接混合后再離心收集 (M1)，以及先離心收集菌體后再向菌體細(xì)胞中添加萃取劑 (M2) 的提取代謝物方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用M1方法難以提取到ATP、ADP這些能量型的磷酸化合物，并且最終在樣品中可檢測(cè)到的每個(gè)代謝物的響應(yīng)值均小于用M2方法提取到的代謝物的響應(yīng)值，例如用M2方法提取到的樣品中檢測(cè)到AcCOA的響應(yīng)值可以達(dá)到M1方法提取的兩倍。因此，先將培養(yǎng)物離心后直接將萃取劑添加到收集的細(xì)胞中能夠起到更好的萃取效果。

在此基礎(chǔ)上，采用MRM的掃描方式，比較了80% () 甲醇/水溶液 (?80 ?C) 作為萃取劑 (M3) 和100%甲醇 (?80 ?C) 作為萃取劑 (M2) 提取24種代謝物的結(jié)果。用80% () 甲醇/水溶液作萃取劑提取到的代謝物的種類比100%甲醇作萃取劑提取的代謝物種類多了8種，且80% () 甲醇/水溶液作萃取劑提取到的代謝物含量要比100%甲醇作萃取劑提取的代謝物含量高，例如AcCOA、NADPH、NADP、UDP-glucose、ATP和GLU等，尤其是ATP和GLU這樣的化合物在細(xì)胞內(nèi)能夠快速被分解，甚至在離心的過(guò)程中，其含量就能發(fā)生很大的變化[33]。隨后又進(jìn)行了兩組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果都證明用80% () 甲醇/水溶液作萃取劑提取到的代謝物的種類比100%甲醇作萃取劑提取的代謝物種類多，且提取到的代謝物含量更高。因此，80% () 甲醇/水溶液作為萃取劑能夠取得更好的結(jié)果。樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 方法的可靠性和重復(fù)性檢測(cè)

LC-MS儀器的穩(wěn)定性是獲得精確數(shù)據(jù)的前提。為了檢驗(yàn)儀器的穩(wěn)定性，本研究首先對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品混合樣 (各物質(zhì)濃度均為50 μmol/L) 進(jìn)行兩次重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)，取兩次數(shù)據(jù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差后計(jì)算變異系數(shù) (Coefficient of variation) 列于表2。對(duì)各化合物的保留時(shí)間進(jìn)行分析，結(jié)果顯示優(yōu)化后的方法可以精確區(qū)分結(jié)構(gòu)類似的化合物如GAP (12.14 min) 和DHAP (14.26 min)、G6P (11.04 min) 和F6P (11.63 min)、ADP (21.10 min) 和ATP (27.36 min)。此外，除了ADP和RiBP的保留時(shí)間變異系數(shù)在1%左右外，其余所有化合物的保留時(shí)間變異系數(shù)均小于1% (表2)。同時(shí)對(duì)各組分的峰面積進(jìn)行分析，結(jié)果顯示大部分化合物的色譜峰峰面積變異系數(shù)均小于10% (表2)。這些結(jié)果表明儀器的重復(fù)性很好。

為了檢驗(yàn)生物學(xué)樣品的重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)選取了一組sp. PCC6803的3個(gè)生物重復(fù)樣進(jìn)行分析，并且將每個(gè)生物重復(fù)樣品進(jìn)樣兩次 (兩個(gè)技術(shù)重復(fù)樣)。本研究以其中一組生物重復(fù)樣為例，對(duì)檢測(cè)到的代謝物數(shù)據(jù)從色譜峰的峰面積和保留時(shí)間兩方面進(jìn)行分析，可以看出各代謝物的色譜峰的峰面積的變異系數(shù)在7.08%到46.02%之間 (表3)，而各代謝物的保留時(shí)間的變異系數(shù)除FBP外，均小于1%。這說(shuō)明生物重復(fù)樣間代謝物的色譜峰的峰面積變化較大?？紤]到生物樣之間的生理代謝差異，以及代謝物提取過(guò)程中復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程和代謝物本身的不穩(wěn)定性，這種偏離應(yīng)該是可以接受的。檢測(cè)到的代謝物中，只有3種代謝物的色譜峰的峰面積的變異系數(shù)在40%左右，它們分別是AMP、F6P和AKG (表3)。

表1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化結(jié)果

“+” represents detected metabolites; “?” represents nondetected metabolites.

表2 LC-MS代謝組分析的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

表3 生物樣間的重復(fù)性檢驗(yàn)

WT-1, WT-2 and WT-3 represent different biological replicates, respectively.

為了檢驗(yàn)技術(shù)重復(fù)樣的分析重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)選取同一樣品進(jìn)行兩次分析并對(duì)檢測(cè)到的代謝物數(shù)據(jù)從色譜峰的峰面積和保留時(shí)間兩方面進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重復(fù)樣WT-1-a和WT-1-b的線性擬合系數(shù)2分別為0.985 5和0.999 7 (圖4A和4B)，這說(shuō)明技術(shù)重復(fù)樣中各個(gè)化合物的色譜峰峰面積和保留時(shí)間相差較小，儀器的穩(wěn)定性良好。

圖4 代謝組分析的重復(fù)性檢驗(yàn) (圖中每個(gè)點(diǎn)均代表一種代謝物，WT-1-a、WT-1-b為WT的不同技術(shù)重復(fù)樣)

3 結(jié)論與展望

本文以模式光合藍(lán)細(xì)菌sp. PCC 6803作為研究對(duì)象，建立并優(yōu)化了基于LC-MS的代謝組學(xué)分析方法。該方法可以對(duì)涉及中心碳代謝和能量代謝的24種重要代謝物進(jìn)行檢測(cè)，包括氧化還原對(duì) (NADPH和NADH) 或者一些易水解的核苷酸類化合物 (ATP、GTP、cAMP和PEP) 等。研究結(jié)果證明選擇具有更好溶解性的萃取劑80% () 甲醇/水溶液，能夠快速破解細(xì)胞，獲取目標(biāo)代謝物。另外，合適的流速和洗脫梯度時(shí)間表不僅能將化合物分離，還能保證整個(gè)分離時(shí)間不至于過(guò)長(zhǎng)，節(jié)約時(shí)間和流動(dòng)相，研究也優(yōu)化了質(zhì)譜參數(shù)。同時(shí)，對(duì)sp. PCC 6803生物重復(fù)樣品進(jìn)行了誤差分析，結(jié)果證明了此代謝組學(xué)分析方法在光合藍(lán)細(xì)菌中的合理應(yīng)用性。在今后的研究中，我們希望將此分析方法結(jié)合其他組學(xué)分析例如蛋白組學(xué)，對(duì)藍(lán)細(xì)菌及微藻等多種類型的光合微生物的生理機(jī)制進(jìn)行研究。此外，這一基于LC-MS的代謝組學(xué)分析方法還可以和同位素標(biāo)記示蹤分析等技術(shù)結(jié)合[34-35]，獲得更為準(zhǔn)確和全面的代謝組學(xué)分析，以實(shí)現(xiàn)對(duì)光合微生物生理代謝更為深入的研究。

Abbreviations

3PG:-(-)-3-Phosphoglyceric acid; AcCOA: Acetyl coenzyme A; ADP: Adenosine 5’- diphosphate; ADP-GCS: Adenosine-5’- diphosphoglucose; AKG: α-Ketoglutaric acid; AMP: Adenosine 5’-monophosphate; ATP: Adenosine 5’-triphosphate; COA: Coenzyme A hydrate; DHAP: Dihydroxyacetone phosphate; FBP:-Fructose 1,6-bisphosphate; F6P:-Fructose 6-phosphate; FUM: Sodium fumarate dibasic; G6P:-Glucose 6-phosphate; GAP:-Glyceraldehyde 3-phosphate; GLU:-Glutamic acid; NAD: α-Nicotinamide adenine dinucleotide; NADH: Reduced α-Nicotinamide adenine dinucleotide; NADP: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; NADPH: Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; OXA: Oxaloacetic acid; PEP: Phospho (enol) pyruvic acid; R5P:-Ribose 5-phosphate; RiBP:-Ribulose1,5-bisphosphate; UDP-GCS: Uridine 5’-diphosphoglucose.

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Optimization and application of targeted LC-MS metabolomic analyses in photosynthetic cyanobacteria

Xiangfeng Niu, Xiaoqing Zhang, Xinheng Yu, Yingxue Su, Lei Chen, and Weiwen Zhang

,,,300072,

To accurately analyze metabolites in industry-important photosynthetic microbes, LC-MS based metabolomics protocol needs to be optimized specifically for individual species. In this study, an LC-MS based metabolomics method was optimized for cyanobacteriumsp. PCC 6803. With the optimized extraction, liquid chromatographic and mass spectral parameters, the method was capable of detecting 24 important metabolites related to central carbohydrate and energy metabolism insp. PCC 6803. The study laid an important foundation for the metabolomics analysis of cyanobacteria.

LC-MS, metabolites, metabolomics, cyanobacterium

July 19, 2014; Accepted:December 1, 2014

Weiwen Zhang. Tel: +82-22-27406394; Fax: +86-22-27403389; E-mail: wwzhang8@tju.edu.cn

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2011CBA00803, 2012CB721101), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA02A707).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (Nos. 2011CBA00803, 2012CB721101)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2012AA02A707) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150115.0941.005.html