重組大腸桿菌利用蔗糖及糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸

李鳳，馬江鋒，吳明科，冀亞亮，陳吳方，任心怡，姜岷

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重組大腸桿菌利用蔗糖及糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸

李鳳，馬江鋒，吳明科，冀亞亮，陳吳方，任心怡，姜岷

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇南京 211816

李鳳, 馬江鋒, 吳明科, 等. 重組大腸桿菌利用蔗糖及糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(4): 534–541.Li F, Ma JF, Wu MK, et al. Succinic acid production from sucrose and sugarcane molasses by metabolically engineered Escherichia coli. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 534–541.

富含蔗糖的甘蔗糖蜜可作為制備丁二酸的廉價原料。然而生產(chǎn)丁二酸的潛力菌株大腸桿菌AFP111不能代謝蔗糖。為了使其具有蔗糖代謝能力，將W中非PTS蔗糖利用系統(tǒng)蔗糖通透酶的編碼基因，果糖激酶的編碼基因和蔗糖水解酶的編碼基因克隆并表達到AFP111中，獲得重組菌株AFP111/pMD19T-。經(jīng)厭氧發(fā)酵驗證，重組菌株72 h消耗20 g/L蔗糖，丁二酸產(chǎn)量達到12 g/L。在3 L發(fā)酵罐中采用有氧階段培養(yǎng)菌體、厭氧階段發(fā)酵的兩階段發(fā)酵方式，厭氧發(fā)酵30 h，重組菌株以蔗糖和糖蜜為碳源丁二酸產(chǎn)量分別為34 g/L和30 g/L。結(jié)果表明，通過外源引入非PTS蔗糖利用系統(tǒng)，重組菌株具有較強的代謝蔗糖生長及合成丁二酸的能力，并且能夠利用廉價糖蜜發(fā)酵制備丁二酸。

大腸桿菌AFP111，非PTS蔗糖利用系統(tǒng)，蔗糖，糖蜜，丁二酸

丁二酸 (Succinic acid) 是一些原核和真核微生物的主要中間代謝產(chǎn)物，作為重要的C4平臺化合物廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)和制藥行業(yè)[1-3]。與化學(xué)合成法相比，生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)丁二酸具有利用可再生資源、能耗低、污染小且在發(fā)酵過程中可固定溫室氣體CO2等優(yōu)點[4-5]。

目前利用廉價廢棄生物質(zhì)作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸成為研究熱點，木質(zhì)纖維素原料如秸稈[6]、玉米芯[7]、甘蔗渣[8]等經(jīng)過處理后得到的水解液中含有大量可發(fā)酵糖如木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等。利用水解液作為生產(chǎn)丁二酸的原料，能夠降低生產(chǎn)成本并減少廢棄生物質(zhì)對環(huán)境造成的污染。制糖工業(yè)中主要的副產(chǎn)物甘蔗糖蜜，與秸稈等木質(zhì)纖維素原料相比，不需要進行預(yù)處理即含有大量的可發(fā)酵糖，其中絕大多數(shù)為蔗糖，同時含有無機鹽、維生素等成分，可提供微生物生長代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)，是十分具有潛力的廉價生物質(zhì)資源[9-10]。

產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌[11]、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌[12]等野生菌可以利用蔗糖生產(chǎn)較高濃度的丁二酸，但因甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，且其發(fā)酵原料成本較高，其工業(yè)化進程受到了阻礙。大腸桿菌由于遺傳背景清晰、易操作、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，被廣泛研究來獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌 株[13-15]。但是目前報道的大多數(shù)大腸桿菌不能利用蔗糖。Lee等[16]通過外源引入來自產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌的使K12具有代謝蔗糖的能力。、、、、基因共同組成PTS蔗糖利用系統(tǒng)。通過導(dǎo)入質(zhì)粒PUR400 (包含、、、、基因)，HD701可以通過PTS蔗糖利用系統(tǒng)代謝蔗糖生產(chǎn)氫氣[17]。Wang等[18]也將PTS蔗糖代謝途徑引入過量表達丙酮酸羧化酶的SBS550MG中，結(jié)果表明重組菌以蔗糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸32.65 g/L，生產(chǎn)強度達到0.34 g/(L·h)。除了PTS蔗糖利用系統(tǒng)，蔗糖的代謝途徑還包含非PTS蔗糖利用系統(tǒng)[19]，該系統(tǒng)包含、、、基因及其自身的啟動子 (圖1)，基因編碼阻遏蛋白會影響蔗糖的利 用[20]，所以基因簇克隆表達時，只克隆、、三個基因。Olson 等[21]將ATCC 13281的引入產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌中，使其能夠以蔗糖為碳源合成酪氨酸，減少生產(chǎn)酪氨酸的成本。

本研究通過引入來自W的非PTS蔗糖利用系統(tǒng)，得到重組菌AFP111/pMD19T-，使原先不能利用蔗糖生長代謝的AFP111具備代謝蔗糖生產(chǎn)丁二酸的能力，其代謝途徑如圖2所示。并考察重組菌利用廉價廢棄甘蔗糖蜜作為碳源經(jīng)濟高效制備丁二酸的可行性。

圖1 E. coli W中csc蔗糖利用系統(tǒng)及其自身啟動子

圖2 AFP111/pMD19T-cscBKA蔗糖代謝途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株W (ATCC 9637) 由本實驗室保藏；菌株AFP111 [F+λ–(Am)?(::Cam) ?(::Kan) ?]，由南伊利諾伊卡本代爾大學(xué)Clark教授惠贈，作為宿主菌和對照菌。質(zhì)粒pMD19-T購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；加A試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA聚合酶和SolutionⅠ連接酶為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品；CO2氣體購自南京上元工業(yè)氣體廠；甘蔗糖蜜購自廣州甘蔗糖業(yè)研究所；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1基因簇的克隆

引物設(shè)計：參照基因簇序列 (來源于W基因組，對應(yīng)的GenBank Accession No.分別為ECW_m2594、 ECW_m2595、ECW_m2596)，設(shè)計不帶酶切位點的引物，并由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 研究中所用到的引物

PCR反應(yīng)體系：模板DNA (i W基因組) (200 ng/μL) 0.5 μL，上下游引物(50 μmol/L)各1 μL，dNTPs (10 mmol/L) 4 μL，10×Pyrobest 緩沖液Ⅱ5 μL，Pyrobest DNA聚合酶 (2.5 U/μL) 1 μL，ddH2O 37.5 μL。總體積50 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 4 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

加“A”反應(yīng)體系：10×A-Tailing緩沖液5 μL，dNTPs 4 μL，PCR回收產(chǎn)物(末端平滑DNA片段260 ng/μL) 10 μL，A-Tailing酶0.5 μL，ddH2O 30.5 μL?？傮w積50 μL。72 ℃反應(yīng)20 min，最終片段平滑末端分別加“A”堿基。

經(jīng)過加A反應(yīng)后的片段，與pMD19-T載體在SolutionⅠ的作用下16 ℃連接過夜，獲得重組質(zhì)粒pMD19T-并轉(zhuǎn)化于AFP111感受態(tài)中。涂布于含氨芐青霉素、氯霉素和硫酸卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑選單菌落，提取質(zhì)粒后進行限制性內(nèi)切酶dⅢ單酶切鑒定。

1.2.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，氯霉素、硫酸卡那霉素和氨芐青霉素添加終濃度分別為25、30、100 μg/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：檸檬酸3 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L，KH2PO48 g/L，(NH4)2HPO48 g/L，NH4Cl 0.2 g/L，(NH4)2SO40.75 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl2·2H2O 10.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.5 mg/L，CuCl2·2H2O 0.25 mg/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.75 mg/L，H3BO30.12 mg/L，Al2(SO4)31.77 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵16.1 mg/L，20.0 mg/L VB1，2.0 mg/L生物素，氯霉素、硫酸卡那霉素和氨芐青霉素添加終濃度分別為25、30、100 μg/mL，根據(jù)需要補加蔗糖或糖蜜。

1.2.4 培養(yǎng)方法

有氧搖瓶培養(yǎng)：將保存于?80 ℃的菌種在加有相應(yīng)抗生素的LB平板上活化，挑單菌落到5 mL LB試管，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，1%接種量接種到含有50 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6?8 h。

厭氧血清瓶發(fā)酵：10%的菌液轉(zhuǎn)接到含有16 g/L堿式碳酸鎂和20 g/L蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，通入過濾除菌后的CO2氣體2 min，保證血清瓶中為厭氧環(huán)境，37 ℃、200 r/min厭氧發(fā)酵，發(fā)酵周期72 h。

3 L發(fā)酵罐兩階段發(fā)酵：將種子液以10%的接種量接入裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐 (BioFlo 110 fermenter；New Brunswick Scientific Co.，Edison，N.J.)。初糖濃度為30 g/L，20% NaOH調(diào)節(jié)pH 6.8，37 ℃有氧培養(yǎng)至初糖耗盡；厭氧階段，無菌過濾條件下通CO2氣體，通氣量0.5 L/min，20%的Na2CO3調(diào)節(jié)pH 6.6，37 ℃、200 r/min厭氧發(fā)酵30 h。

1.2.5 發(fā)酵及代謝物分析

細胞生長量用紫外可見分光光度計于波長600 nm處測定吸光度值，細胞干重 (Dry cell weight，DCW) 由600換算得到，換算公式為：DCW (g/L)=0.4×600。發(fā)酵過程中糖及有機酸用高效液相色譜法 (HPLC) 檢測。色譜柱BP-100Pb++用來分析發(fā)酵過程中的蔗糖、葡萄糖及果糖，流動相為ddH2O，流速0.4 mL/min，柱溫80 ℃，示差折光檢測器檢測。色譜柱Prevail Organic Acid用來分析發(fā)酵過程中的有機酸，流動相為25 mmol/L KH2PO4(pH 2.5)，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測器檢測，檢測波長215 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1基因簇的克隆與表達

PCR擴增后得到的基因片段經(jīng)過加A反應(yīng)與載體pMD19-T進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19T-。

重組質(zhì)粒pMD19T-經(jīng)dⅢ酶切后得到的條帶為6 575 bp (圖3)，結(jié)果與預(yù)期一致。測序結(jié)果顯示目的片段與公布的序列100%匹配。

2.2 重組菌株AFP111/pMD19T-與出發(fā)菌株AFP111厭氧搖瓶利用蔗糖生產(chǎn)丁二酸比較

以蔗糖為唯一碳源進行純厭氧血清瓶發(fā)酵,比較出發(fā)菌株AFP111和重組菌株AFP111/pMD19T-利用蔗糖生產(chǎn)丁二酸的能力，結(jié)果如表2所示。

72 h純厭氧發(fā)酵結(jié)束后，出發(fā)菌株AFP111細胞干重僅為0.24 g/L，沒有蔗糖消耗且沒有丁二酸的積累，表明該菌株不能利用蔗糖生產(chǎn)丁二酸；而AFP111/pMD19T-通過外源引入非PTS蔗糖利用系統(tǒng)，細胞干重達到1.51 g/L，丁二酸產(chǎn)量為12 g/L，丁二酸得率為1.1 mol/mol單糖 (葡萄糖或者果糖)，表明重組菌株具有了代謝蔗糖并積累丁二酸的能力。

2.3 3 L發(fā)酵罐中AFP111/pMD19T-利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸

大腸桿菌作為兼性厭氧菌，其在有氧條件下生長速度及細胞密度均高于厭氧，因此采用先有氧快速培養(yǎng)獲得高密度菌體，進而厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的兩階段發(fā)酵模式，可大幅提高丁二酸的生產(chǎn)速率。有氧階段以30 g/L蔗糖為碳源培養(yǎng)重組菌株AFP111/pMD19T-細胞干重達到12 g/L，然后通入無菌CO2轉(zhuǎn)成厭氧發(fā)酵階段。發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。厭氧發(fā)酵30 h后，丁二酸濃度達到34 g/L，丁二酸的得率為1.16 mol/mol單糖，丁二酸的生產(chǎn)強度為1.13 g/(L·h)。

非PTS蔗糖利用系統(tǒng)中，蔗糖通透酶 (CscB) 將胞外的蔗糖轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，胞內(nèi)的蔗糖被蔗糖水解酶 (CscA) 水解為葡萄糖和果糖，理論上胞外沒有單糖的存在。重組菌株AFP111/pMD19T-生長及發(fā)酵的過程中，顯現(xiàn)出很高的分解蔗糖的能力，當DCW達到12 g/L時，30 g/L的蔗糖30 min內(nèi)全部分解為單糖，細胞外即培養(yǎng)基中檢測到大量的葡萄糖和果糖 (圖4A)。并且外源引入PTS蔗糖代謝途徑的SBS550MG pHL413 pUR400在發(fā)酵過程中培養(yǎng)基里也有單糖的存在。這是由于外源引入蔗糖利用系統(tǒng)的重組菌株蔗糖分解的速度高于葡萄糖和果糖的利用速率，胞內(nèi)積累的單糖滲透到胞外[18]。

圖3 重組質(zhì)粒pMD19T-cscBKA的單酶切鑒定

表2 對照菌與重組菌以蔗糖為唯一碳源厭氧發(fā)酵結(jié)果

ND: not detected. Each value is the mean of three parallel replicates±standard deviation ().

2.4 3 L發(fā)酵罐中AFP111/pMD19T-利用糖蜜發(fā)酵制備丁二酸

在3 L發(fā)酵罐中考察重組菌AFP111/pMD19T-以甘蔗糖蜜作為碳源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的情況。經(jīng)HPLC測定，糖蜜中糖的組分為355 g/L蔗糖、84 g/L葡萄糖、84 g/L果糖，設(shè)定發(fā)酵初始糖濃度為30 g/L，其中20.4 g/L蔗糖、4.8 g/L葡萄糖、4.8 g/L果糖，發(fā)酵結(jié)果見圖5。

圖4 E. coli AFP111/pMD19T-cscBKA在3 L發(fā)酵罐中以蔗糖為碳源厭氧發(fā)酵階段的細胞干重、糖(A) 及產(chǎn)物 (B) 濃度

圖5 E. coli AFP111/pMD19T-cscBKA在3 L發(fā)酵罐中以糖蜜為碳源厭氧發(fā)酵階段的細胞干重、糖 (A) 及產(chǎn)物 (B) 濃度

發(fā)酵過程中，糖蜜中的單糖沒有影響蔗糖的分解，與純蔗糖發(fā)酵過程相似，糖蜜中的蔗糖快速分解為葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖被同步利用，這由于宿主菌AFP111的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS) 的基因自發(fā)突變，解除了碳分解代謝物阻遏現(xiàn)象，因此重組菌在利用葡萄糖和果糖時不存在順序性。厭氧發(fā)酵30 h，丁二酸濃度達到30 g/L，丁二酸的得率為1.13 mol/mol單糖，丁二酸的生產(chǎn)強度為1.0 g/(L·h)。通過甘蔗糖蜜與蔗糖發(fā)酵結(jié)果對比可知，以甘蔗糖蜜為碳源發(fā)酵制備丁二酸的生產(chǎn)強度略低于純蔗糖發(fā)酵，這可能由于未經(jīng)處理的糖蜜中含有金屬離子、膠體等，這些物質(zhì)不利于菌體生長代謝[22]。

3 結(jié)論

Bruschi等[23]以pCR2.1為載體克隆來自W中3個基因及其自身啟動子，使重組菌株能夠以蔗糖為碳源生長。本研究證明pMD19-T也可以作為載體克隆表達三個基因，且蔗糖利用系統(tǒng)轉(zhuǎn)入到產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株AFP111中，重組大腸桿菌AFP111/pMD19T-具有利用蔗糖和廉價糖蜜發(fā)酵制備丁二酸的能力。厭氧搖瓶中，以20 g/L蔗糖為初始糖濃度，72 h產(chǎn)生12 g/L丁二酸。采用有氧厭氧兩階段發(fā)酵，厭氧發(fā)酵30 h后，以蔗糖為碳源時產(chǎn)生了34 g/L丁二酸，丁二酸的得率為1.16 mol/mol單糖，丁二酸的生產(chǎn)強度為1.13 g/(L·h)；以糖蜜為碳源時產(chǎn)生了30 g/L丁二酸，丁二酸的得率為 1.13 mol/mol單糖，丁二酸的生產(chǎn)強度為1.0 g/(L·h)。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Succinic acid production from sucrose and sugarcane molasses by metabolically engineered

Feng Li, Jiangfeng Ma, Mingke Wu, Yaliang Ji, Wufang Chen, Xinyi Ren, and Min Jiang

State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu, China

Sugarcane molasses containing large amounts of sucrose is an economical substrate for succinic acid production. However,AFP111 cannot metabolize sucrose although it is a promising candidate for succinic acid production. To achieve sucrose utilizing ability, we cloned and expressedgenes encoding sucrose permease, fructokinase and invertase of non-PTS sucrose-utilization system fromW inAFP111 to generate a recombinant strain AFP111/pMD19T-. After 72 h of anaerobic fermentation of the recombinant in serum bottles, 20 g/L sucrose was consumed and 12 g/L succinic acid was produced. During dual-phase fermentation comprised of initial aerobic growth phase followed by anaerobic fermentation phase, the concentration of succinic acid from sucrose and sugarcane molasses was 34 g/L and 30 g/L, respectively, at 30 h of anaerobic phase in a 3 L fermentor. The results show that the introduction of non-PTS sucrose-utilization system has sucrose-metabolizing capability for cell growth and succinic acid production, and can use cheap sugarcane molasses to produce succinic acid.

AFP111, non-PTS sucrose-utilization system, sucrose, sugarcane molasses, succinic acid

July 9, 2014; Accepted:October 27, 2014

Min Jiang. Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-84172062; E-mail: bioengine@njtech.edu.cn

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