高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定生物樣品中的有機(jī)汞

王曉雯 王 煒 李玉璞

(大連市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧 大連 116023)

汞是是自然界中常見的污染物之一，其毒性依賴于它的化學(xué)形態(tài)及其濃度，有機(jī)汞的毒性要比無機(jī)汞的強(qiáng)。其中甲基汞是有機(jī)汞中毒性最強(qiáng)的汞化合物之一。研究表明，在微生物的作用下，環(huán)境中的無機(jī)汞可以通過生物甲基化、乙基化、苯基化等反應(yīng)生成相應(yīng)的有機(jī)汞，而有機(jī)汞可被動(dòng)植物吸收，并通過食物鏈富集，最終危害人類健康［1］。鑒于不同形態(tài)汞化合物的毒性差異，采用高靈敏度的形態(tài)分析方法測(cè)定環(huán)境樣品和生物樣品中汞的含量非常必要［2］。

目前，高效分離技術(shù)與高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用已經(jīng)成為汞形態(tài)分析的主要手段。氣相色譜(GC)和液相色譜(HPLC)是常用的分離手段，原子熒光光譜(AFS)，原子吸收光譜(AAS)，電感耦合等離子體－原子發(fā)射光譜(ICP－AES)以及電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP－MS)作為檢。測(cè)手段廣泛應(yīng)用于汞形態(tài)的分析。其中HPLC－ICP－MS 以其靈敏度高、線性范圍寬、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，成為各聯(lián)機(jī)應(yīng)用分析汞形態(tài)的首選［3－10］。

分析生物樣品中的有機(jī)汞的前處理方法主要是以酸提取，堿消解和微波消解為主，使用HPLC－ICP－MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析，由于苯基汞需高比例有機(jī)相的洗脫，易造成ICP－MS 熄火，因此目前應(yīng)用該方法進(jìn)行汞的形態(tài)分析主要集中在甲基汞和乙基汞上，僅有曹程明［11］，彭國(guó)俊［12］和張?zhí)m［13］等人在各自的研究中涉及到了生物體中的苯基汞，其中，只有曹程明在研究中做了苯基汞的回收率研究。本文在酸提取的基礎(chǔ)上，以苯作為萃取溶劑，用超聲輔助萃取，硫代硫酸鈉溶液作為反萃取劑進(jìn)行樣品前處理，用HPLC 分離，ICP－MS 儀器增加了加氧裝置和有機(jī)專用矩管，建立了測(cè)定生物樣品中甲基汞、乙基汞和苯基汞的分析方法。所建立的HPLC－ICP－MS 方法在10min 內(nèi)即可完全分離分析3種有機(jī)汞形態(tài)，大大縮短了樣品的分析時(shí)間，適合于生物樣品中汞形態(tài)的快速萃取分析要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Agilent 7500ce ICP－MS，配備加氧裝置和1.5mm有機(jī)矩管;Agilent 1200 HPLC;超聲波清洗器;離心機(jī);振蕩儀;凍干機(jī)。

L－半胱氨酸(優(yōu)級(jí)純);乙酸銨(優(yōu)級(jí)純);苯(色譜純);甲醇(色譜純);濃鹽酸溶液(ρ=1.19g/mL);硫代硫酸鈉(c=0.01mol/L);甲基汞、乙基汞、苯基汞標(biāo)準(zhǔn)貯備液(ρ=10μg/mL)。

1.2 儀器工作參數(shù)

1.2.1 高效液相色譜參數(shù)設(shè)置

Agilent Zorbax Plus C18色譜柱，4.6mm×150mm，5μm;流動(dòng)相:A 相為0.01moL/L 乙酸銨/0.12% L－半胱氨酸，氨水調(diào)節(jié)pH=7.5，經(jīng)0.45μm 濾膜過濾;B相為甲醇。流動(dòng)相流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量50μL;梯度洗脫，總時(shí)間為20min。洗脫條件見表1。

1.2.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置

入射功率1500W;采樣深度10.0mm;玻璃同心霧化器;石英霧化室與炬管;霧室采用半導(dǎo)體控溫于－5℃;Pt 采樣錐和截取錐;采樣模式:Time program．同位素:Hg202，積分時(shí)間0.5s。對(duì)應(yīng)梯度洗脫條件分別設(shè)定最匹配的ICP－MS 儀器參數(shù)，梯度洗脫過程中采用合適的調(diào)諧文件，以保證梯度洗脫過程中各階段汞的靈敏度均最佳，氧氬混合氣比例見表1。

表1 液相色譜洗脫條件及質(zhì)譜調(diào)諧文件設(shè)定

1.3 樣品的采集和前處理

取生物體的可食部分，依次用去離子水和超純水洗凈后，再用紗布拭干水分，打碎均勻后，然后置于凍干機(jī)冷凍干燥72h，充分干燥后粉碎成干粉儲(chǔ)存于密閉玻璃瓶中，冷凍保存。同時(shí)準(zhǔn)確記錄凍干前后重量，并由此獲得樣品水分含量。

稱取0.2g 干樣品于50mL 的離心管中，加入10mL超純水，5mL 濃鹽酸和10mL 苯，超聲萃取25min，振蕩10min，5000r/min 離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50mL 的離心管中。下層溶液加入5mL 苯，重復(fù)上述操作，合并上清液。加入5mL 硫代硫酸鈉溶液超聲萃取30min，離心，下層水溶液過膜進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的選擇

王煒等在研究中使用Zorbax Plus C18色譜柱，乙酸銨/L－半胱氨酸，甲醇體系下，采用梯度洗脫程序進(jìn)行3 種有機(jī)汞形態(tài)的分離［14］。經(jīng)過研究比較，6min 之前均采用92%醋酸銨/L－半胱氨酸溶液+ 8%甲醇以便實(shí)現(xiàn)甲基汞、乙基汞的迅速分離，分離度與峰形均較為理想，在6min 后將甲醇比例直接提高至45%以實(shí)現(xiàn)苯基汞的快速洗脫。10min 內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)3 種有機(jī)汞的完全分離。在苯基汞分離之后，為保證下一個(gè)樣品的正常分析，11min 后恢復(fù)至92%醋酸銨/L－半胱氨酸溶液+8%甲醇體系，直至20min 樣品分析完畢。圖1 為濃度為10μg/L 的3 種有機(jī)汞形態(tài)的色譜分離圖，保留時(shí)間依次為甲基汞2.260min，乙基汞4.270min，苯基汞9.340min。

2.2 萃取溶液的選擇

曹程明在他的研究中采用鹽酸－甲苯為提取試劑，L－半胱氨酸溶液反萃取，前處理效果良好，甲基汞的回收率大于70%，乙基汞和苯基汞的回收率均大于50%［11］。由于甲苯為易制毒試劑，采購(gòu)程序復(fù)雜，本研究使用苯替代甲苯作為提取溶劑。

2.3 反萃取液的選擇

圖1 3 種有機(jī)汞的譜圖

由于單純采用L－半胱氨酸溶液進(jìn)行反萃取，乙基汞的回收率不穩(wěn)定，而大多數(shù)研究均采用硫代硫酸鈉溶液反萃取，甲基汞、乙基汞和苯基汞的回收率較高［11］。

因此，本研究使用鹽酸－苯為提取試劑，超聲萃取后，硫代硫酸鈉溶液反萃取的樣品前處理方法，所得的甲基汞和乙基汞的回收率大于90%，苯基汞的回收率大于50%。

2.4 校準(zhǔn)曲線的制備

用流動(dòng)相配制濃度為0.50，1.00，5.00，10.0，50.0μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)行測(cè)定。對(duì)不同濃度的甲基汞、乙基汞以及苯基汞所對(duì)應(yīng)的峰積分面積作圖，線性范圍和回歸方程見表2。甲基汞、乙基汞和苯基汞均在0.50～50.0μg/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9998。

表2 不同汞形態(tài)的線性范圍和回歸方程

2.5 方法檢出限、精密度和準(zhǔn)確度

由于魚肉和貝類樣品中含有甲基汞，在檢出限的測(cè)定中，向0.2g 樣品中加入2.50ng 的乙基汞和苯基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，另外加入25.0ng 的三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合物做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。在上述條件下測(cè)定生物樣品，鹽酸－苯為提取試劑，超聲萃取后，硫代硫酸鈉溶液反萃取后，相應(yīng)的萃取液濃度分別為0.50μg/L(乙基汞和苯基汞)和5.00μg/L，上機(jī)測(cè)試，平行測(cè)定7 次，做加標(biāo)回收試驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算方法檢出限、精密度和準(zhǔn)確度。魚肉中甲基汞的檢出限為0.030mg/kg，乙基汞的檢出限為0.013mg/kg 苯基汞的檢出限為0.010mg/kg;貝類中甲基汞的檢出限為0.038mg/kg，乙基汞的檢出限為0.019mg/kg，苯基汞的檢出限為0.015mg/kg。不同濃度樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%－12.2%之間，兩個(gè)水平加標(biāo)回收率在50.8～129%之間，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定與加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

本文采用酸提取法進(jìn)行樣品前處理，并利用HPLC－ICP－MS 聯(lián)用技術(shù)建立了魚肉和貝類中汞形態(tài)的分析方法。在前處理方法和色譜、質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化下，選擇以鹽酸－苯為提取試劑，超聲萃取后，硫代硫酸鈉溶液反萃取，以L－半胱氨酸為螯合劑，Plus C18柱分離汞化合物形態(tài)。將所建立的方法應(yīng)用于生物樣品中的汞形態(tài)分析，靈敏度高，3 種有機(jī)汞的方法檢出限在0.010～0.038mg/kg 以內(nèi)，以加標(biāo)回收的方式研究了該方法對(duì)生物樣品的適用性，加標(biāo)回收率在50.8～129%之間，兩個(gè)添加水平的回收率和精密度均能滿足日常分析需要，方法準(zhǔn)確、可靠，為生物樣品中的汞形態(tài)分析測(cè)定提供了有用的參考。

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