姜黃素改善大鼠創(chuàng)傷性腦損傷炎性反應(yīng)及預(yù)后

陽又蓮，張 新，羅 揚(yáng)，劉 宿

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，重慶400038；2.武警重慶市總隊(duì)醫(yī)院，重慶400061；3.解放軍324醫(yī)院，重慶400020；4.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所麻醉科，重慶400042）

姜黃素改善大鼠創(chuàng)傷性腦損傷炎性反應(yīng)及預(yù)后

陽又蓮1，張 新2，羅 揚(yáng)3，劉 宿4

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，重慶400038；2.武警重慶市總隊(duì)醫(yī)院，重慶400061；3.解放軍324醫(yī)院，重慶400020；4.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所麻醉科，重慶400042）

目的探究姜黃素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的治療作用及機(jī)制。方法將12只SD大鼠隨機(jī)分為姜黃素組（6只）和DMSO組（6只），為每只大鼠建立TBI模型，治療組給予姜黃素治療3 d，對(duì)照組腹腔注射等量DMSO。每天測量體質(zhì)量和神經(jīng)功能評(píng)分至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在第5天（高峰期）取大鼠腦組織，用免疫組織化學(xué)法染色觀察巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥浸潤，用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β的相對(duì)表達(dá)。第25天（恢復(fù)期）取大鼠腦組織，用RT-PCR方法檢測IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果神經(jīng)功能評(píng)分顯示姜黃素治療后大鼠TBI嚴(yán)重度顯著降低，姜黃素能抑制TBI高峰期巨噬細(xì)胞在大鼠腦組織中的炎癥浸潤與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，抑制TBI高峰期腦組織TNF-α、IL-1β表達(dá)，促進(jìn)TBI恢復(fù)期IL-10及TGF-β的表達(dá)。結(jié)論姜黃素對(duì)TBI有治療作用，這種治療作用可能與姜黃素抑制TBI后炎性反應(yīng)、促進(jìn)組織恢復(fù)有關(guān)。

姜黃素； 腦損傷； 炎癥； 巨噬細(xì)胞； 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞； 免疫組織化學(xué)

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）發(fā)病率逐年增高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國每年約有200萬人遭受TBI[1]，而中國龐大的人口基數(shù)和日益發(fā)展的社會(huì)建設(shè)增加了腦損傷的危險(xiǎn)因素；腦損傷不僅對(duì)成年人危害極大，嬰幼兒腦損傷帶來的危害也不容小覷，在我國，腦損傷已被列入新生兒時(shí)期危害最嚴(yán)重的疾病之一[2]。因此，研究TBI潛在的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)措施是大勢所趨?；谀壳暗难芯?，腦損傷大致可分為2個(gè)部分：（1）創(chuàng)傷部位直接的物理損傷，這種損傷是不可逆的；（2）以大腦缺血缺氧、過度炎性反應(yīng)等為代表的二次損傷，這種損傷發(fā)生率為44.5%[3]，主要體現(xiàn)在患者的體溫改變、血壓及顱內(nèi)壓的波動(dòng)甚至腦組織壞死等，可加重原發(fā)損傷，也可造成腦水腫，嚴(yán)重者可致癱瘓、死亡[4]，因此，二次損傷為患者帶來的遠(yuǎn)期危害遠(yuǎn)甚于原發(fā)損傷。

二次損傷有許多細(xì)胞成分與炎癥介質(zhì)的共同參與，其中血液來源的巨噬細(xì)胞和腦組織的小膠質(zhì)細(xì)胞扮演著主要角色，它們貫穿于TBI的整個(gè)病程，能吞噬病原體以阻止傷口感染、分泌大量炎癥因子參與炎性反應(yīng)，還能參與到炎癥消退和組織修復(fù)中[5]。因此，以巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞作為靶點(diǎn)研究TBI的干預(yù)措施是一個(gè)理想的途徑。

姜黃素作為一種食品添加劑廣泛應(yīng)用于人們的日常生活。目前，越來越多的研究表明，姜黃素不僅具有食品著色功能，還具備抗氧化、抗炎、抗凝、降脂等多種功能[6-7]。本實(shí)驗(yàn)擬探究其對(duì)TBI的治療作用及其潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取12只清潔級(jí)雄性SD大鼠，周齡7～9周，體質(zhì)量160～200 g，全部購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，正常飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房。將大鼠隨機(jī)分為姜黃素組（6只）和DMSO組（6只）。

1.1.2 主要儀器 離心機(jī)Centrifuge 5804R（Effendorf，Germany）、Nanodrop紫外分光光度計(jì)、PCR儀PTC-100（MJ Research，USA）、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）儀（MJ Research，USA）、顱骨轉(zhuǎn)、自由落體打擊器等。

1.1.3 主要試劑 姜黃素、DMSO（Sigma），4%多聚甲醛溶液（武漢博士德），抗CD68單克隆抗體（Serotec，UK），改進(jìn)型枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液、免疫染色封閉液、免疫染色一抗稀釋液、免疫染色二抗稀釋液（碧云天生物），Trizol裂解液（羅氏公司），Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMaster（SYBGGreen）RT-PCR試劑盒（北京天根生物）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠TBI模型的建立 10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠于操作臺(tái)上，備皮，用剪刀剪開頭皮并充分暴露前囟、冠狀縫和矢狀縫及頂骨，之后用顱骨轉(zhuǎn)以前囟后3.0 mm、向右旁開矢狀縫2.5 mm為中心做一直徑約為5.0 mm顱骨鉆孔，全過程不損傷硬腦膜。之后，將自由落體裝置底座輕置于顱骨鉆孔表面，以20 g重物自14 cm高處沿套管下落打擊致傷，致傷直徑5 mm，最大下陷距離3 mm，最后將大鼠置于37℃恒溫室至蘇醒。

1.2.2 治療 造模當(dāng)天為第1天，1 h后對(duì)姜黃素組每只大鼠腹腔注射100 mg/kg姜黃素后每12小時(shí)注射1次，共注射6次，DMSO組采用相同方法注射相等量DMSO。每天稱體質(zhì)量并進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分按Sinson等[8]采用的方法實(shí)施，即在造模后第0、5、25天分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行計(jì)分。

1.2.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 提起鼠尾后大鼠左側(cè)和右側(cè)前肢屈曲狀況；提起鼠尾后大鼠前肢仍留在平面上，左側(cè)和右側(cè)后肢屈曲狀況；對(duì)抗左側(cè)和右側(cè)推力狀況（以上各項(xiàng)評(píng)分各為5檔，0為嚴(yán)重?fù)p傷，4為正常）；在斜板上左、右、垂直方向的站立能力（50.0°為4分，42.5°為3分，40.0°為2分，37.5°為1分），各項(xiàng)相加即為總評(píng)分（總分共36分）。

1.2.4 TBI大鼠腦組織炎癥因子表達(dá) 損傷前5 d為TBI炎癥高峰期，第5天用乙醚處死大鼠后迅速解剖腦組織并投入液氮保存。使用Trizol裂鮮液在冰上研磨樣本并提取總RNA，用Nanodrop紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，之后取1 μg總RNA使用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒按說明書逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。按說明書使用RealMaster（SYBG Green）RT-PCR試劑盒對(duì)兩組cDNA樣本進(jìn)行RT-PCR檢測。引物如下：β-actin上游引物5′-CCGTCT TCC CCT CCATCGT-3′，下游引物5′-ATC GTC CCA GTT GGT TAC AAT GC-3′；TNF-α上游引物5′-TGA TCG GTC CCA ACA AGG A-3′，下游引物5′-TGC TTG GTG GTT TGC TAC GA-3′；IL-1β上游引物5′-TGC TGA TGT ACC AGT TGG GG-3′，下游引物5′-CTC CAT GAG CTT TGT ACA AG-3′；IL-10上游引物5′-CCT GCT CTT ACT GGC TGG AG-3′，下游引物5′-TCT CCC AGG GAA TTC AAA TG-3′；TGF-β上游引物5′-TGA ACC AAG GAG ACG GAA TAC AGG-3′，下游引物5′-TAC TGT GTG TCC AGG CTC CAA ATG-3′。

1.2.5 TBI大鼠腦組織免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色 第5天用水合氯醛深度麻醉大鼠后于左心室內(nèi)灌注預(yù)冷多聚甲醛溶液。迅速解剖大鼠大腦后用多聚甲醛4℃固定過夜，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。脫蠟，腦組織切片在改進(jìn)型枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中煮沸15 min進(jìn)行抗原修復(fù)。用新配的甲醇/過氧化氫混合液處理15 min以抑制過氧化氫酶，然后于封閉液室溫孵育1 h，以阻止非特異性免疫球蛋白的結(jié)合。使用抗CD68單克隆抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行單因素t檢驗(yàn)分析；P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組TBI大鼠在第0、5、25天運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評(píng)分及體質(zhì)量比較 在造模第5、25天，姜黃素組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分優(yōu)于DMSO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1；在造模第5、25天，姜黃素組大鼠體質(zhì)量顯著高于DMSO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表1 兩組TBI大鼠第0、5、25天運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，分）

表1 兩組TBI大鼠第0、5、25天運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，分）

注：與DMSO組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05。

組別DMSO組姜黃素組n 第0天 第5天 第25天6 6 35.50±0.83 35.00±1.10 17.00±2.53 22.50±3.27a28.33±2.94 34.50±1.23a

表2 兩組TBI大鼠第0、5、25天體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 兩組TBI大鼠第0、5、25天體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與DMSO組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05。

組別DMSO組姜黃素組n 第0天 第5天 第25天6 6 196.7±13.4 192.7±18.1 157.3±12.3 190.2±14.0a230.2±11.4 316.7±20.6a

2.2 姜黃素抑制TBI高峰期巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞在大鼠腦組織中的炎癥浸潤 TBI高峰期（第5天）大鼠腦組織CD68+細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果見圖1。姜黃素組大鼠腦組織CD68+細(xì)胞染色密度顯著低于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖1 姜黃素抑制TBI高峰期（第5天）CD68+細(xì)胞在腦組織中的炎癥浸潤（SP法，400×）

2.3 姜黃素抑制TBI高峰期腦組織炎癥因子表達(dá) 對(duì)大鼠TBI高峰期（第5天）腦組織中炎癥因子mRNA表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析結(jié)果見圖2。姜黃素組腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素（IL）-1βmRNA表達(dá)較DMSO組顯著減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖2 姜黃素抑制TBI高峰期（第5天）TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)

2.4 姜黃素促進(jìn)TBI恢復(fù)期IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的表達(dá) 對(duì)大鼠TBI恢復(fù)期（第25天）腦組織中炎癥因子mRNA表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析結(jié)果見圖3。姜黃素組IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)較DMSO組顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖3 姜黃素促進(jìn)TBI恢復(fù)期（第25天）IL-10、TGF-β mRNA的表達(dá)

3 討 論

炎性反應(yīng)是TBI繼發(fā)病理過程的重要部分。已有研究表明，多種炎癥成分參與了TBI的進(jìn)程，其表達(dá)譜的差異反映TBI的嚴(yán)重程度[9]，其中，巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞是TBI后炎性反應(yīng)的主要參與者。一方面，它們扮演著中樞神經(jīng)系統(tǒng)“清道夫”的角色，能快速吞噬凋亡、壞死的組織或細(xì)胞[10]；另一方面，它們能分泌 TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β等多種炎癥因子參與到炎性反應(yīng)中去。TNF-α在TBI早期具有神經(jīng)毒性作用[11]；IL-1β能促進(jìn)TBI后炎性反應(yīng)，并有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，降低IL-1β的表達(dá)能有效緩解出血性腦損傷[12]；IL-10與TGF-β能抑制腦組織炎性反應(yīng)，且TGF-β能促進(jìn)腦損傷后腦組織的修護(hù)[13]。因此，這些指標(biāo)與腦損傷的程度、病程變化、預(yù)后等密切相關(guān)，可以作為反映TBI療效的指標(biāo)[14]。

姜黃素被證實(shí)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有保護(hù)作用。Han等[15]發(fā)現(xiàn)姜黃素能通過抑制T細(xì)胞的炎性激活從而改善大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎；在小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中，姜黃素能預(yù)防線粒體損傷與缺氧狀況[16]；除此之外，姜黃素被證實(shí)對(duì)神經(jīng)痛[17]、阿爾茨海默病[18]、脊髓損傷[19]具有治療作用。在TBI中，姜黃素能預(yù)防TBI后腦出血[20]，能改善TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的急性炎性反應(yīng)[21]，并對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用[22]；然而，目前尚鮮有文獻(xiàn)評(píng)估TBI后炎癥高峰期（第5天）和恢復(fù)期（第25天）姜黃素的療效，本研究結(jié)果提示，在TBI炎癥高峰期，姜黃素能顯著抑制巨噬細(xì)胞的浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減弱了促炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，提示這些作用與姜黃素減輕神經(jīng)功能障礙相關(guān)；在TBI恢復(fù)期，姜黃素能增強(qiáng)促組織修復(fù)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)，結(jié)合姜黃素顯著性改善大鼠TBI后期神經(jīng)功能，說明姜黃素能促進(jìn)TBI后期腦組織的修復(fù)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示姜黃素是一個(gè)貫穿TBI全程的、具有抗炎與組織保護(hù)功能的理想TBI治療藥物。由于本研究采用腹腔注射姜黃素的方式評(píng)估其對(duì)大鼠TBI的治療作用，臨床應(yīng)用上還有一定局限性，因此，探索出合適的姜黃素口服劑量將具備更好的臨床應(yīng)用前景。

[1]Corps KN，Roth TL，McGavern DB.Inflammation and neuroprotection in traumatic brain injury[J].JAMA Neurol，2015，72（3）：355-362.

[2]母得志，李熙鴻.新生兒腦損傷及修復(fù)[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2009，24（2）：83-86.

[3]費(fèi)舟，章翔.二次腦損傷[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2006，5（5）：471-473.

[4]沙龍金，夏昌興，曾文盛，等.二次腦損傷對(duì)顱腦損傷預(yù)后的影響[J].中原醫(yī)刊，2006，33（5）：20-21.

[5]Zhang ZY，Zhang Z，F(xiàn)auser U，et al.Global hypomethylation defines a sub-population of reactive microglia/macrophages in experimental traumatic brain injury[J].Neurosci Lett，2007，429（1）：1-6.

[6]Jurenka JS.Anti-inflammatory properties of curcumin，a major constituent of Curcuma longa：a review of preclinical and clinicalresearch[J].Altern Med Rev，2009，14（2）：141-153.

[7]Shishodia S，Sethi G，Aggarwal BB.Curcumin：getting back to the roots[J]. Ann NY Acad Sci，2005，1056：206-217.

[8]Sinson G，Voddi M，Mcintosh TK.Combined fetal neural transplantation and nerve growth factor infusion：effects on neurological outcome following fluid-percussion brain injury in the rat[J].J Neurosurg，1996，84（4）：655-662.

[9]Lagraoui M，Latoche JR，Cartwright NG，et al.Controlled cortical impact and craniotomy induce strikingly similar profiles of inflammatory gene expression，but with distinct kinetics[J].Front Neurol，2012，3：155.

[10]Nayak D，Roth TL，McGavern DB.Microglia development and function[J]. Annu Rev Immunol，2014，32：367-402.

[11]Allan SM，Rothwell NJ.Cytokines and acute neurodegeneration[J].Nat Rev Neurosci，2001，2（10）：734-744.

[12]Schielke GP，Yang GY，Shivers BD，et al.Reduced ischemic brain injury in interleukin-1 beta converting enzyme-deficient mice[J].J Cereb Blood Flow Metab，1998，18（2）：180-185.

[13]Morganti-Kossmann MC，Rancan M，Otto VI，et al.Role of cerebral inflammation after traumatic brain injury：a revisited concept[J].Shock，2001，16（3）：165-177.

[14]賀曉生.重視對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷炎癥反應(yīng)的研究[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（9）：769-771.

[15]Han F，Luo B，Shi R，et al.Curcumin ameliorates rat experimental autoimmune neuritis[J].J Neurosci Res，2014，92（6）：743-750.

[16]Feng J，Tao T，Yan W，et al.Curcumin inhibits mitochondrial injury and apoptosis from the early stage in EAE mice[J].Oxid Med Cell Longev，2014，2014：728751.

[17]Lee JH，Kim YD，Jung HC，et al.The effect of intrathecal curcumin on mechanical allodynia in rats after L5 spinal nerve ligation[J].Korean J Anesthesiol，2014，67 Suppl：S122-123.

[18]Feng HL，F(xiàn)an H，Dang HZ，et al.Neuroprotective effect of curcumin to Aβ of double transgenic mice with Alzheimer′s disease[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2014，39（19）：3846-3849.

[19]Zhang J，Wei H，Lin M，et al.Curcumin protects against ischemic spinal cord injury：The pathway effect[J].Neural Regen Res，2013，8（36）：3391-3400.

[20]Chen TH，Yang YC，Wang JC，et al.Curcumin treatment protects against renal ischemia and reperfusion injury-induced cardiac dysfunction and myocardial injury[J].Transplant Proc，2013，45（10）：3546-3549.

[21]Zhu HT，Bian C，Yuan JC，et al.Curcumin attenuates acute inflammatory injury by inhibiting the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in experimental traumatic brain injury[J].J Neuroinflammation，2014，11：59.

[22]NoorafshanA，AbdollahifarMA，Karbalay-DoustS.Stresschanges the spatial arrangement of neurons and glial cells of medial prefrontal cortex and sertraline and curcumin prevent it[J].Psychiatry Investig，2015，12（1）：73-80.

Curcumin for ameliorating inflammatory reaction and prognosis in traumatic brain injury in rat

Yang Youlian1，Zhang Xin2，Luo Yang3，Liu Su4
（1.Students Brigade，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；2.Chongqing Municipal Corps Hospital of Armed Police Forces，Chongqing 400061，China；3.324 Hospital of PLA，Chongqing 400020，China；4.Department of Anesthesiology，Daping Hospital，Research Institute of Field Surgery，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect and the potential mechanism of curcumin for treating traumatic brain injury（TBI）.Methods12 SD rats were randomly divided into the curcumin group（6 cases）and the DMSO group（control，6 cases）.After TBI model was established，each rat in the curcumin group was treated with curcumin for 3 d，while the DMSO group was given the equal quantity of DMSO by intraperitoneal injection.The body mass and neurological functional score were daily measured from the beginning to the end of experiment.On 5 d（peak period），the brain tissue was taken for observing the macrophage/microglia inflammatory infiltration in the brain by the immunohistochemistry staining.The real time quantitative RT-PCR was performed for detecting the relative expression of TNF-α and IL-1β.On 25 d（recovery period），the brain tissue was taken for detecting the relative expressions of IL-10 and TGF-β in brain by RT-PCR.ResultsThe neurological functional scores showed that the severity degrees of the rat TBI were significantly decreased after curcumin treatment，indicating that curcumin could inhibit the macrophage infiltration and microglia activation in the rat brain tissue，inhibited the expression of TNF-α and IL-1β in the brain tissue during the peak period and promoted the expression of IL-10 and TGF-β during the recovery period of TBI.ConclusionCurcumin has the curative effect on TBI，which may be related with curcumin inhibiting the inflammatory reaction after TBI and promoting the tissue recovery.

Curcumin； Brain injury； Inflammation； Macrophage； Microglia； Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.20.004

A

1009-5519（2015）20-3056-03

2015-06-04）

陽又蓮（1970-），女，湖南冷水江人，碩士研究生，主要從事創(chuàng)傷護(hù)理研究；E-mail：443601147@qq.com。

劉宿（E-mail：liusu3691@qq.com）。