細(xì)胞團(tuán)塊收集器聯(lián)合免疫標(biāo)記在良、惡性胸水中的應(yīng)用研究*

韓軍平，王麗曾，羅文瀟，馬文霞，達(dá)春和

（甘肅省白銀市第一人民醫(yī)院1.病理科，2.呼吸科，甘肅白銀730900）

·臨床論著·

細(xì)胞團(tuán)塊收集器聯(lián)合免疫標(biāo)記在良、惡性胸水中的應(yīng)用研究*

韓軍平1，王麗曾1，羅文瀟1，馬文霞1，達(dá)春和2

（甘肅省白銀市第一人民醫(yī)院1.病理科，2.呼吸科，甘肅白銀730900）

目的探討細(xì)胞團(tuán)塊收集器聯(lián)合免疫標(biāo)記在良、惡性胸水中的應(yīng)用。方法采用細(xì)胞團(tuán)塊收集器收集胸水，將臨床送檢的115例胸水制作細(xì)胞切片，蘇木精-伊紅染色法（HE）、免疫組織化學(xué)法染色，行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒別診斷，并與2009～2013年送檢的胸水標(biāo)本經(jīng)傳統(tǒng)細(xì)胞涂片或液基薄層技術(shù)細(xì)胞診斷結(jié)果進(jìn)行比較研究。結(jié)果115例胸水中，經(jīng)免疫及形態(tài)學(xué)證實(shí)為惡性胸水18例，惡性細(xì)胞檢出率為16％，傳統(tǒng)細(xì)胞涂片胸水癌細(xì)胞檢測陽性率為5％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在異型性細(xì)胞中，Ki-67、癌胚抗原（CEA）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（TTF-1）、Napsin-A、細(xì)胞角蛋白7（CK7）在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)較好；而Calretinin、間皮細(xì)胞（MC）、Wilms腫瘤基因（WT1）在間皮細(xì)胞中表達(dá)較好，其表達(dá)率在良、惡性胸水中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論利用細(xì)胞團(tuán)塊聯(lián)合免疫標(biāo)記能極大地提高良、惡性胸水診斷的準(zhǔn)確率，并能客觀地對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分型，提高癌細(xì)胞檢出率、準(zhǔn)確率，有利于腫瘤分型。

細(xì)胞團(tuán)塊收集器；良、惡性胸水；肺腺癌；免疫標(biāo)記

胸、腹水脫落細(xì)胞檢查，可用于判斷胸、腹水的良、惡性及惡性腫瘤類型和來源，為臨床診治、判斷預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。傳統(tǒng)的細(xì)胞涂片或液基薄層細(xì)胞涂片技術(shù)因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量有限，細(xì)胞重疊堆積、薄厚不均、結(jié)構(gòu)不清，所以惡性腫瘤細(xì)胞檢出率、準(zhǔn)確率較低。本研究利用細(xì)胞團(tuán)塊收集器收集體液標(biāo)本中細(xì)胞的方法，收集胸水中脫落細(xì)胞，并檢測間皮細(xì)胞（mesothelial cell，MC）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcriptionfactor-1，TTF-1）、Calretinin、Napsin-A、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、Ki-67、細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）等，結(jié)合蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）病理形態(tài)鑒別良、惡性胸水，并進(jìn)行腫瘤分型，為治療提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料與試劑

選取甘肅省白銀市第一人民醫(yī)院2014年1月-2014年9月臨床送檢胸水標(biāo)本115例，所有標(biāo)本利用細(xì)胞團(tuán)塊收集器制作細(xì)胞團(tuán)塊。同時(shí)收集2009年1月-2013年1月病理科胸水脫落細(xì)胞診斷結(jié)果。細(xì)胞團(tuán)塊收集器、蛋白螯合劑為本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)；免疫組織化學(xué)法染色過程所需單克隆抗體：Ki-67、Calretinin、MC、CEA、Wilms腫瘤基因（Wilms'tumor gene，WT1）、TTF-1、Napsin-A、CK7及鼠抗人單克隆抗體CK5/6，試劑盒UltraSensitive SP購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作陰性對(duì)照組。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

臨床抽取的胸、腹水標(biāo)本除做其他檢查外，其余全部立即送檢，一般為200～800 ml。將胸水標(biāo)本測量體積，按照1∶10的比例加入4％甲醛溶液，標(biāo)本以10％福爾馬林固定。自然沉降30～60 min，棄上清液，留沉淀物30～50 ml，置入50 ml離心管中，2 000 r/min離心10 min。棄上清液，取沉淀物1～2滴進(jìn)行常規(guī)涂片，并在剩余沉淀物中加入1 ml 95％乙醇，混勻沉淀物，加入1滴蛋白螯合劑，混勻；將混合液全部置入細(xì)胞團(tuán)塊收集器中，2 000 r/min離心10 min，取出細(xì)胞團(tuán)塊，包埋、常規(guī)脫水、透明、浸蠟后包埋，制成4μm厚的細(xì)胞塊石蠟切片，HE染色，免疫組織化學(xué)法檢測，細(xì)胞切片和細(xì)胞涂片對(duì)比觀察，鑒別胸水的良、惡性，同時(shí)診斷腫瘤類型。

1.3結(jié)果判斷

細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《細(xì)胞病理學(xué)診斷圖譜及實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[1]。所有涂片、切片經(jīng)2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科副主任醫(yī)師閱片，胸水癌細(xì)胞陽性患者，需經(jīng)病理活檢資料證實(shí)或臨床綜合資料的驗(yàn)證；免疫組織化學(xué)法染色中Calretinin、MC、CEA、Napsin-A、CK7、CK5/6蛋白在細(xì)胞膜中表達(dá)，Ki-67、WT1、TTF-1蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)，為棕黃色顆粒；陽性細(xì)胞率＞10％為陽性[2]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率表示，兩兩間用χ2檢驗(yàn)并行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12009～2014年同期胸水標(biāo)本癌細(xì)胞檢出率

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)2009～2014年1～9月份同期胸、腹水標(biāo)本癌細(xì)胞檢出率進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2009～2013年1～9月份使用傳統(tǒng)細(xì)胞涂片或液基薄層細(xì)胞涂片技術(shù)，胸、腹水癌細(xì)胞檢測陽性率為5％；2014年同期使用團(tuán)塊收集器，胸、腹水癌細(xì)胞檢測陽性率為16％，是以往普通涂片胸、腹水癌細(xì)胞檢測陽性率的3倍多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.856，P=0.023）（見表1）。分析其原因：①關(guān)鍵是不能對(duì)送檢胸、腹水所有細(xì)胞進(jìn)行檢測；②細(xì)胞涂片免疫組織化學(xué)法效果沒有細(xì)胞切片免疫組織化學(xué)法效果好（見圖1～4）。

2.2免疫組織化學(xué)表達(dá)特點(diǎn)

表1 2009～2014年同期胸、腹水標(biāo)本癌細(xì)胞檢出率

31例核異型性胸水中，病理細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)17例肺腺癌，1例為神經(jīng)內(nèi)分泌癌，并得到組織學(xué)證實(shí)。在17例肺腺癌中，CEA、TTF-1、Napsin-A及CK7全部表達(dá)，Calretinin、MC不表達(dá)，WT1＜20％，Ki-67增殖指數(shù)為（25.47±24.0）。Ki-67、Calretinin、MC、CEA、TTF-1、Napsin-A及CK7在間皮細(xì)胞增生及肺腺癌間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），WT1、CK5/6在間皮細(xì)胞增生及肺腺癌間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖1 細(xì)胞涂片見巢團(tuán)狀、單個(gè)排列的瘤細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊（HE×200）

圖2 細(xì)胞切片中見腺樣排列的瘤細(xì)胞（HE×200）

圖3 組織切片見癌組織成乳頭狀、腺管狀、條索狀排列，浸潤至纖維間質(zhì)（HE×200）

圖4 免疫組織化學(xué)結(jié)果，癌細(xì)胞CK7+（×200）

表2 31例核異型性胸水患者的免疫組織化學(xué)表達(dá)特點(diǎn)

3 討論

胸、腹水脫落細(xì)胞檢查是判斷良、惡性及惡性腫瘤類型和來源的主要手段，為臨床診治、判斷預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。引起胸、腹水常見的原因有肺癌、乳腺癌、卵巢癌、消化道腫瘤、淋巴瘤及間皮瘤等，準(zhǔn)確判斷胸、腹水中細(xì)胞是間皮細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞，或其他類型腫瘤細(xì)胞，為臨床治療和預(yù)后提供重要依據(jù)。傳統(tǒng)的細(xì)胞涂片或液基薄層細(xì)胞涂片技術(shù)由于細(xì)胞數(shù)量多，涂片厚，免疫組織化學(xué)法難以進(jìn)行質(zhì)量控制，在鑒別診斷中存在困難[3]。

本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)一種細(xì)胞團(tuán)塊收集器及收集方法，極大地提高惡性腫瘤細(xì)胞檢出率及準(zhǔn)確率。利用細(xì)胞團(tuán)塊收集器制作法，收集脫落細(xì)胞制作石蠟包埋切片具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可以把患者送檢的胸、腹水、尿液等體液標(biāo)本固定細(xì)胞后全部包埋切片，可連續(xù)切片，減少漏診，提高脫落細(xì)胞的陽性檢出率。②克服傳統(tǒng)涂片中細(xì)胞重疊堆積、薄厚不均、結(jié)構(gòu)不清的現(xiàn)象，確保對(duì)細(xì)胞學(xué)的正確診斷。③可長期保存，反復(fù)重切，并能做多種特殊染色或免疫組織化學(xué)法檢測，對(duì)惡性腫瘤的分類有很大幫助，減少誤診，為臨床治療提供依據(jù)和方便。該方法具有很大的推廣和應(yīng)用前景[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，Napsin-A對(duì)原發(fā)性肺腺癌、鱗狀細(xì)胞癌及其他轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的診斷具有較高的敏感性和特異性[5-7]。本實(shí)驗(yàn)顯示，原發(fā)性肺腺癌中Napsin-A呈強(qiáng)陽性，表達(dá)率為100％，具有較高的特異性；其在轉(zhuǎn)移性腺癌、鱗癌及肺良性胸腔積液中未見陽性表達(dá)，與相關(guān)報(bào)道一致[8]。國內(nèi)外關(guān)于TTF-1在肺癌中的研究報(bào)道較多，且研究結(jié)果顯示，TTF-1主要在肺腺癌和小細(xì)胞癌中表達(dá)，肺腺癌中TTF-1的陽性表達(dá)率為27％～100％[9]。同時(shí)TTF-1在原發(fā)性肺腺癌中的表達(dá)具有較高的敏感性和特異性，可作為一種有價(jià)值的標(biāo)記物，用于原發(fā)和轉(zhuǎn)移性肺腺癌的鑒別；本研究顯示，TTF-1表達(dá)率為100％，具有較高的特異性，與相關(guān)報(bào)道一致[10]。CK7是許多腺上皮及移行上皮中的一種堿性角蛋白（如肺、乳腺、卵巢等），CEA是一種胎兒腸道產(chǎn)生的癌胚抗原，在肺腺癌中高表達(dá)。Calretinin是一種細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白，和MC主要在正常和腫瘤性間皮細(xì)胞中表達(dá)。Ki-67是判斷細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，其高、低與許多腫瘤的分化程度、浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，通過細(xì)胞團(tuán)塊收集器及收集方法聯(lián)合檢測Ki-67、Calretinin、MC、CEA、WT1、TTF-1、Napsin-A、CK7及CK5/6免疫標(biāo)記物，可鑒別良、惡性胸水，是判斷反應(yīng)性間皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞組織學(xué)來源的較好指標(biāo)。

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（童穎丹 編輯）

Application of cell mass collector combined with immune markers in diagnosis of benign and malignant pleural effusion*

Jun-ping HAN1,Li-zeng WANG1,Wen-xiao LUO1,Wen-xia MA1,Chun-he DA2
(1.Department of Pathology,2.Department of Respiratory Diseases,the First People's Hospital of Baiyin,Baiyin,Gansu 730900,P.R.China)

【Objective】】To apply cell mass collector combined with immune markers in the diagnosis of benign and malignant pleural effusion.【Methods】Pleural effusion of 115 cases was collected with the cell clump collector.Effusion smears were checked through H.E.staining and immunohistochemical staining.Cell morphology was observed and differential diagnosis was made.Then the results were compared with the diagnostic results of traditional cell smear and thin liquid layer technology for pleural effusion from 2009 to 2013.【Results】In 115 cases with pleural effusion,18 cases were confirmed to have malignant pleural effusion by immunohistochemistry and morphology.The positive rate of malignant cells was 16％while it was 5％using traditional cell smear of pleural effusion,and there was a significant difference between them(P＜0.05).CEA,Napsin-A,TTF-1,CK7 and Ki-67 were expressed in the lung adenocarcinoma cells,while MC,WT1 and calretinin were expressed in mesothelial cells,and there were significant differences in the positive rates between benign and malignant pleural effusion(P＜0.05).【Conclusions】Application of cell mass collector combined with immune markers can improve the diagnosis of benign and malignant pleural effusion,increase the detection rate and accuracy and facilitate classification of malignant tumor cells.

cell mass collector;benign and malignant pleural effusion;lung adenocarcinoma;immune marker

R365

A

1005-8982（2015）35-0062-04

2015-05-26

甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計(jì)劃項(xiàng)目（No：GSWSKY-2015-69）