維生素D受體基因BsmⅠ多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病的相關性研究*

王珍珍，王學梅，嚴媚，劉玉

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，新疆烏魯木齊830054）

·臨床論著·

維生素D受體基因BsmⅠ多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病的相關性研究*

王珍珍，王學梅，嚴媚，劉玉

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，新疆烏魯木齊830054）

目的探討維生素D受體（VDR）基因BsmⅠ位點單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族兒童急性白血病（AL）的相關性。方法以新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科150例急性白血病患者（維吾爾族83例，漢族67例）及161例（維吾爾族75例，漢族86例）同期健康體檢兒童為研究對象，用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）檢測VDR基因BsmⅠ多態(tài)性分布。結果①白血病患兒與對照組的BsmⅠ基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.326和5.983，P=0.009和0.014）；②對于維吾爾族兒童，病例組與對照組的BsmⅠ基因型（GG+GA/AA）、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.296和1.027，P=0.255和0.311）；而對于漢族兒童，病例組與對照組的BsmⅠ基因型（GG+GA/AA）、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.414和6.661，P=0.001和0.010）。③就白血病患兒而言，維吾爾族與漢族的BsmⅠ基因型、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=7.797和2.518，P=0.180和0.113）；對照組中維吾爾族與漢族的BsmⅠ基因型、等位基因分布差比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.650和0.000，P=0.420和0.993）。結論白血病患兒與非白血病患兒VDR基因BsmⅠ的多態(tài)性分布區(qū)別不大，BsmⅠ的多態(tài)性分布與白血病有相關性。其中BsmⅠ基因分布與漢族兒童白血病有相關性，而與維吾爾族兒童白血病無關。無論在白血病患兒或正常兒童，BsmⅠ基因型分布都不存在民族差異。

維生素D受體基因；兒童；白血??；維吾爾族；漢族

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是一組高度異質性的造血干細胞惡性、克隆性疾病，是兒童時期最常見的惡性腫瘤，居兒童惡性腫瘤死亡率的首位，嚴重威害兒童的健康[1-2]。白血病的發(fā)病機制非常復雜，分子生物學研究證明AL的本質是多基因異常引起的惡性腫瘤，涉及許多癌基因的激活和/或抑癌基因的失活，是一個多步驟的過程[3-4]，近十幾年來，人們先后在多種白血病細胞系中發(fā)現維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）的表達。VDR在多種白血病細胞的表達使學者們認為白血病細胞是維生素D和VDR作用的靶細胞，VDR基因可能是白血病的易感基因[5]。VDR基因與急性白血病的相關性開始受到關注，但研究較少且結論不一致。本研究采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法，對新疆維吾爾族、漢族VDR基因BsmⅠ位點多態(tài)性與急性白血病的相關性進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象

選取2013年09月-2015年1月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科經細胞形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學及分子生物學（morphology immunology cytogenetics molecular，MICM）分型確診的150例兒童為病例組，在知情同意的原則下選取同期在兒科預防保健門診體檢的161例非白血病兒童為對照組。排除合并其他惡性腫瘤及其他嚴重心、腦、腎疾病的患兒；年齡28 d～14歲，平均（3.56±0.58）歲，個體間無血緣關系。

1.2方法

1.2.1 儀器與試劑全血提取DNA試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供，PCR正、反向引物由上海生工生物工程技術服務有限公司生產，限制性內切酶由美國MBI公司生產，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix及100 bp DNA Ladder Marker、10×TBE電泳緩沖液由大連寶生生物工程有限公司生產，瓊脂糖和溴化乙錠分別由法國Biowest agre公司和美國Sigma公司生產。

1.2.2 DNA提取晨起空腹采集新鮮靜脈血1～2ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，進行DNA提取。

1.2.3 PCR擴增和DNA測序①引物序列：通過美國國家生物信息中心（National Center of Biology Information，NCBI）的Gene Bank獲取VDR基因序列及BsmⅠ位點的單核苷酸多態(tài)性信息，利用Primer 5.0軟件設計引物序列。BsmⅠ正向引物：5'-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3'，BsmⅠ反向引物：5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAG GG-3'，②PCR擴增：PCR反應體系包括DNA模板0.2μg，正、反向引物各0.2μl，Premix Taq 10μl，滅菌雙蒸水補足反應總體積至20μl。PCR擴增反應條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5 min，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。③PCR-RFLP分析：取PCR產物10μl，加入0.2μl相應的限制性內切酶及緩沖液，恒溫37℃水浴箱中酶切90 min。酶切產物于2％瓊脂糖凝膠上電泳30 min，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析基因型。④隨機抽取經PCR-RFLP確定的不同基因型的PCR產物各兩例送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果用Chromas軟件讀出后與Gene Bank序列進行對比。

1.2.4 質量控制①所有調查人員經過系統(tǒng)培訓；②實驗在盲法下進行；③隨機抽取10％標本行重復性實驗，監(jiān)測基因型與之前結果完全一致。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料以率表示，Hardy-Weinberg遺傳平衡和不同組的基因型分布、等位基因頻率比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1基因型的PCR-RFLP分析

BsmⅠ可分別得到3種基因型：①等位基因無酶切位點的純合子出現203bp 1條帶，表示為AA；②只有1個酶切位點的雜合子出現461、258和203 bp 3條帶，表示為GA；③有兩個酶切位點的純合子出現258和203 bp兩條帶，表示為GG。見圖1。

圖1 VDR-PCR產物經BsmⅠ酶切后的電泳圖

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

將對照組中漢族及維吾爾族兒童的BsmⅠ基因位點的實際頻數與理論頻數進行χ2檢驗，結果顯示，差異無統(tǒng)計學意義，表明BsmⅠ基因位點分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2=1.171和0.980，P=0.560和1.000）。見表1。

2.3病例組和對照組BsmⅠ基因型及等位基因的分布特點

白血病與非白血病患兒3種BsmⅠ基因型分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.326，P=0.009）；等位基因分布比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.983，P=0.014）。見表2。

2.4不同民族病例組和對照組BsmⅠ基因型的分布特點

漢族病例組與對照組GG+GA/AA基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.414和6.661，P=0.001和0.010）；維吾爾族病例組與對照組GG+GA/AA基因型、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.296和1.027，P=0.255和0.311）。見表3。

2.5病例組和對照組不同民族BsmⅠ基因位點多態(tài)性的分布特點

病例組中漢族與維吾爾族GG+GA/AA基因型、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=7.797和2.518，P=0.180和0.113）；對照組中BsmⅠ基因分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.650和0.000，P=0.420和0.993）。見表4。

表1 對照組漢族及維吾爾族兒童維生素D受體BsmⅠ基因位點的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

表2 病例組和對照組BsmⅠ基因多態(tài)性及等位基因的分布比較例（％）

表3 不同民族病例組和對照組BsmⅠ基因多態(tài)性的分布比較

表4 病例組和對照組不同民族BsmⅠ基因位點的分布比較

3 討論

維生素D是脂溶性維生素，對人類健康特別是兒童健康具有重要意義。VDR能在全身多個系統(tǒng)器官組織中表達，并具有多種功能，如調節(jié)激素分泌、影響免疫功能、調節(jié)細胞增生與分化等[6]。人體內幾乎所有組織細胞及腫瘤細胞均有VDR存在，這可能是維生素D及其類似物影響多種腫瘤細胞的原因之一[7]。最近較多國內外研究發(fā)現，維生素D還能調節(jié)多種正?；蚰[瘤組織細胞的生長和分化，該作用是通過維生素D3受體介導[8-9]。目前研究表明，VDR與多種腫瘤有相關性。劉靜波等[10]研究顯示，VDR基因BsmⅠ位點多態(tài)性與肺腺癌發(fā)病風險有相關性，BsmⅠ位點B等位基因可能增加肺腺癌的發(fā)病風險。有研究顯示，VDR基因多態(tài)性與乳腺癌存在一定的相關性[11]。國外研究顯示，中國漢族人群與歐洲人種BsmⅠ基因多態(tài)性位點分布比較。差異有統(tǒng)計學意義[12]。寧夏回族自治區(qū)的一項研究顯示，漢族與回族BsmⅠ基因多態(tài)分性分布比較。差異有統(tǒng)計學意義，因此維生素D受體基因多態(tài)性可能存在民族差異。

本研究通過對漢維族的白血病患兒、非白血患兒的BsmⅠ不同基因型進行檢測，以證實不同基因型VDR在維、漢患兒白血病發(fā)生中的重要作用。本研究結果表明，白血病及非白血病患兒BsmⅠ基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計學意義，提示白血病的發(fā)生與BsmⅠ有相關性，與鄭敏等[13]在廣西漢族白血病患兒維生素D受體基因多態(tài)性的研究結果不同。MANCHANDA等[14]研究結果表明，病例組與對照組BsmⅠ位點多態(tài)性分布比較差異無統(tǒng)計學意義，提示VDR基因BsmⅠ酶切位點的多態(tài)性可能與兒童白血病的遺傳易感性無關。但國外研究顯示，病例組與對照組BsmⅠ位點多態(tài)性分布比較，差異有統(tǒng)計學意義[14]，與新疆地區(qū)的白血病基因分布相似。本研究加入民族因素，將漢族及維吾爾族的病例組及對照組分別進行分析，漢族的白血病患兒與對照組的BsmⅠ基因型分布、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計學意義，但維吾爾族兒童的分析結果與其相反，并且無論在病例組還是對照組中，漢族與維吾爾族的上述基因分布比較差異無統(tǒng)計學意義，與國外ZHANG等[12]研究結果不同。但上述研究并未涉及漢族與維吾爾族的比較，其初步結論提示維、漢患兒的BsmⅠ基因型分布無明顯區(qū)別。不同地區(qū)、不同人種的遺傳因素可能不同。環(huán)境因素的差異，以及環(huán)境及遺傳因素的相互作用使基因型分布更復雜。本研究僅限于在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診的兒童，樣本量受限，有待進一步研究。

[1]JACOBYE,CHIEN CD,FRY TJ.Murine models of acute leukemia∶important tools in current pediatric leukemia research[J].Front Oncol,2014,4(95)∶1-13.

[2]SISON EA,BROWN P.Does hematopoietic stem cell transplantation benefit infants with acute leukemia[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2013,2013∶601-604.

[3]LIANG KL,RISHI L,KEESHAN K.Tribbles in acute leukemia[J].Blood,2013,121(21)∶4265-4270.

[4]WINTER SS.Pediatric acute leukemia therapies informed by molecular analysis of high-risk disease[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2011,2011∶366-373.

[5]HE Q,ANANABA GA,PATRICKSON J,et al.Chlamydial infection in vitamin D receptor knockout mice is more intense and prolonged than in wild-type mice[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2013,135∶7-14.

[6]鄭敏,劉強.維生素D及維生素D受體的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2013,19(21)∶3965-3967.

[7]ZHAO Y,LIAO S,HE J,et al.Association of vitamin D receptor gene polymorphisms with metabolic syndrome∶a case-control design of population-based cross-sectional study in north China[J].Lipids Health Dis,2014,13∶129.

[8]AREESHI MY,MANDAL RK,AKHTER N,et al.Evaluating the association between taqi variant of vitamin D receptor gene and susceptibility to tuberculosis∶a meta-analysis[J].Toxicol Int,2014,21(2)∶140-147.

[9]GHORBANIHAGHJO A,ARGANI H,SAMADI N,et al.Relationship between vitamin D receptor gene foki and apai polymorphisms and serum levels of fetuin-A,vitamin D,and parathyroid hormone in patients on hemodialysis[J].Iran J Kidney Dis,2014,8(5)∶394-400.

[10]劉靜波,侯燕燕,齊曦明,等.維生素D受體基因多態(tài)性與肺腺癌易感性的關系[J].河北醫(yī)藥,2014(12)∶1780-1782.

[11]鮑劉莉,李哲光,彭景.維生素D代謝與乳腺癌預防[J].揚州大學烹飪學報,2012,29(2)∶50-53.

[12]ZHANG K,SONG L.Association between vitamin D receptor gene polymorphisms and breast cancer risk∶a meta-analysis of 39 studies[J].PLoS One,2014,9(4)∶1-9.

[13]鄭敏,羅建明.維生素D受體基因BsmI位點多態(tài)性與兒童白血病易感性的關系研究[J].實用醫(yī)學雜志,2010,26(21)∶3896-3898.

[14]MANCHANDA PK,BID HK.Vitamin D receptor and type 2 diabetes mellitus∶growing therapeutic opportunities[J].Indian J Hum Genet,2012,18(3)∶274-275.

（童穎丹 編輯）

Association of vitamin D receptor geneBsmⅠpolymorphism in Han and Uighur children with acute leukemia*

Zhen-zhen WANG,Xue-mei WANG,Mei YAN,Yu LIU
(Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830054,P.R.China)

【Objective】To investigate the relationship between vitamin D receptor(VDR)geneBsmⅠpolymorphism and hereditary susceptibility of Han and Uighur children with acute leukemia.【Methods】The VDR geneBsmⅠwas detected in 150 children with acute leukemia(83 Uighur and 67 Han)and 161 healthy controls(75 Uighur and 86 Han)using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method.【Results】①There were statistically significant differences in frequencies ofBsmⅠgenotype and the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls(χ2=9.326 and 5.983,P=0.009 and 0.014).②There was no significant difference in frequencies ofBsmⅠgenotype(GG+GA/AA)or the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls of Uighur children(χ2=1.296,1.027;P=0.255,0.311),while there were statistically significant differences in frequencies ofBsmⅠgenotype(GG+GA/AA)and the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls of Han children(χ2=10.414 and 6.661,P=0.001 and 0.010).③There was no significant difference in frequencies ofBsmⅠgenotype or the alleles of either acute leukemia cases(χ2=7.797,2.518;P=0.180,0.113)or healthy controls(χ2=0.650,and 0.000;P=0.420 and 0.993)between the Han and Uighur children.【Conclusions】Polymorphism distribution of VDR geneBsmⅠis associated with acute leukemia of Han children,but not associated with acute leukemia of Uighur children.BsmⅠis not associated with ethic difference.

vitamin D receptor gene;child;acute leukemia;Uighur;Han

R733.7

A

1005-8982（2015）35-0058-04

2015-10-20

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院科研項目（No：2012QN04）

嚴媚，E-mail：yan10mei25@163.com；Tel：13669901666