大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

廖真，寧輝，劉偉，蘆偉

（湖北省恩施州來鳳縣中心醫(yī)院普外胸外科，湖北恩施445700）

·論著·

大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

廖真，寧輝，劉偉，蘆偉

（湖北省恩施州來鳳縣中心醫(yī)院普外胸外科，湖北恩施445700）

目的檢測大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2（RASAL2）在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，探討其與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性及意義。方法應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)印跡及免疫組織化學(xué)法檢測RASAL2在42例結(jié)腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)，分析其與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果qRT-PCR及蛋白質(zhì)印跡檢測顯示，RASAL2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（P＜0.05）；免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果顯示，RASAL2在結(jié)腸癌組織中的高表達(dá)率明顯低于癌旁組織（42.9％vs 88.1％，χ2=19.012，P＜0.01），且RASAL2的表達(dá)與腫瘤的Dukes分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論RASAL2在結(jié)腸癌中的低表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為相關(guān)。

大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2；結(jié)腸癌；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；蛋白質(zhì)印跡；免疫組織化學(xué)法

在我國，隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅國人的生命健康。目前研究認(rèn)為，癌基因激活及抑癌基因失活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）是由Ras基因編碼且具有鳥苷三磷酸酶活性，其在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種人類腫瘤中存在異常突變，并廣泛參與腫瘤的惡性生物學(xué)進(jìn)程，是最為重要的原癌基因之一[1-2]，大鼠肉瘤蛋白樣激活劑2（rat sarcoma protein activator like 2，RASAL2）是一種大鼠肉瘤三磷酸鳥苷（rat sarcoma guanosine triphosphate，RasGTP）酶活性蛋白，其能加快RasGTP酶的活性，關(guān)閉Ras信號通路，實(shí)施負(fù)性調(diào)控[3]，現(xiàn)有研究表明，RASAL2在乳腺癌、星形細(xì)胞瘤、卵巢癌及肺癌中表達(dá)下降，并具有潛在的腫瘤抑制作用[4-7]。目前，關(guān)于RASAL2在結(jié)腸癌中的研究尚未見報(bào)道，本研究通過多種分子生物學(xué)方法檢測RASAL2在結(jié)腸癌中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本材料

選取2012年6月-2014年6月本院診斷為結(jié)腸癌并行手術(shù)切除患者的組織標(biāo)本共42例，所有標(biāo)本經(jīng)病理確診。其中男性30例，女性12例；中位年齡58.5歲。腫瘤位于近段結(jié)腸26例，遠(yuǎn)端結(jié)腸16例。按Duke病理分期：A期12例，B期7例，C期20例，D期3例。按分化程度：高分化10例，中分化18例，低分化14例。按浸潤深度：侵及漿膜者29例，未侵及漿膜者13例。經(jīng)病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。同期腫瘤切除后距腫瘤邊緣＞5 cm的腸管黏膜為癌旁組織，所有標(biāo)本在手術(shù)切除后立即置于液氮中低溫保存。所有病例術(shù)前未行放射治療或化學(xué)治療。42例標(biāo)本常規(guī)行石蠟包埋，另取其中12例新近收集的組織（包括癌及癌旁組織）進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡檢測。

1.2主要試劑

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RASAL2及GAPDH引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，兔抗人RASAL2多克隆抗體購自英國Abcam公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Proteintech公司，免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 qRT-PCR按Trizol說明書提取組織樣品總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Rever Tra Ace qPCR-RT kit，日本TOYOBO公司）說明書二步法合成cDNA，產(chǎn)物保存于-80℃。根據(jù)qRT-PCR試劑盒（SYBR Green Realtime PCR Master Mix，日本TOYOBO公司）說明書在熒光定量PCR儀（ABI7500）上進(jìn)行檢測。RASAL2正向引物序列為：5'-TGGGCCGAGAGC TTTCAGTTTTGC-3'，反向引物序列為：5'-TTGCCAC GGTCGCCTGTAGGA-3'；GAPDH正向引物序列為5'-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，反向引物序列為5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'。樣本中目的基因與內(nèi)參基因（GAPDH）循環(huán)閾值的差異為ΔCT，實(shí)驗(yàn)樣本與對照樣本（正常腸管黏膜組織）ΔCT的差異為ΔΔCT，以2-ΔΔCT表示基因的相對表達(dá)量，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡檢測提取組織中的總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測蛋白濃度。30μg蛋白/泳道上樣，10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。5％脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入RASAL2一抗（1∶800）和GAPDH一抗（1∶5 000）于雜交袋中4℃孵育過夜，含吐溫的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（tris buffered saline with tween，TBST）洗膜后二抗（1∶3 000）室溫孵育2 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）法于凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad）拍照，然后用圖像分析軟件Image J進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白與GAPDH的光密度比值。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色所有標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4μm厚切片。RASAL2一抗的工作濃度為1∶100，操作步驟按照即用型免疫組織化學(xué)SABC檢測試劑盒說明書進(jìn)行，用已知陽性的結(jié)腸癌切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。免疫組織化學(xué)染色由2位高年資病理科醫(yī)生以盲法觀察確定，RASAL2主要為胞漿著色，按照參照文獻(xiàn)[8]的判定標(biāo)準(zhǔn)，每張切片隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野（每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞），計(jì)算陽性細(xì)胞百分率及染色程度，以陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及細(xì)胞染色程度評分的乘積進(jìn)行綜合判斷。陽性細(xì)胞數(shù)＜5％為0分，5％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，＞75％為4分；不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分，結(jié)果判定總分≤3為低表達(dá)，總分＞3為高表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RASAL2 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，在12對結(jié)腸癌組織中有10對（83.3％）癌旁組織的RASAL2 mRNA表達(dá)水平高于對應(yīng)的癌組織（見圖1A）；以癌旁組織和癌組織的均值作箱形圖，兩者RASAL2 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）（見圖1B）。

2.2蛋白質(zhì)印跡檢測

12對結(jié)腸癌組織中有10對（83.3％）癌旁組織的RASAL2蛋白（129kD）表達(dá)量高于對應(yīng)的癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）。見圖2。

圖1 qRT-PCR檢測結(jié)腸癌和癌旁組織中RASAL2 mRNA的表達(dá)

2.3RASAL2蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測12對結(jié)腸癌和癌旁組織中RASAL2蛋白的表達(dá)

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測RASAL2蛋白在結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達(dá)（SABC×200）

免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果顯示，RASAL2在所有癌旁及大部分癌組織中有表達(dá)，主要定位于胞漿，呈棕黃色顆粒狀分布（見圖3）。42例結(jié)腸癌組織中RASAL2高表達(dá)率為42.9％（18/42），而癌旁組織中RASAL2高表達(dá)率為88.1％（37/42），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.012，P＜0.01）。

2.4RASAL2蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，RASAL2蛋白表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小及分化程度等無關(guān)（P＞0.05）；而與腫瘤的Dukes分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。見附表。

附表 結(jié)腸癌臨床病理特征與RASAL2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

結(jié)腸癌常常起病隱匿且發(fā)展快，確診為早期階段結(jié)腸癌5年生存率＞90％，當(dāng)有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時下降為65％，而有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時則＜10％[9]。這表明侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌治療失敗的最主要原因，也是患者致死和影響長期存活的主要因素。目前，研究認(rèn)為結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因改變和多因素參與的復(fù)雜過程，其中癌基因的激活及抑癌基因功能失活在該過程中占主要地位[10-11]。

Ras基因包括H-Ras、K-Ras和N-Ras 3種，K-ras是目前已知最常被激活的原癌基因之一，其基因突變在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮極為重要的作用[12-13]。而最新研究表明，Ras蛋白過度活化及其下游信號通路的調(diào)節(jié)異?？赡芘cRas基因抑制物Ras GAP的下調(diào)或缺失有關(guān)[14-15]。RASAL2是Ras GAPs家族的主要成員之一，近期研究發(fā)現(xiàn)其能通過多種途徑抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，是潛在的抑癌基因，MCLAUGHLIN等[4]報(bào)道RASAL2在原發(fā)性乳腺癌中顯著低表達(dá)，且低表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)。而無論是在乳腺癌細(xì)胞系還是動物模型中，抑制RASAL2能激活Ras，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。WEEKS等[5]發(fā)現(xiàn)在星形細(xì)胞瘤中，RASAL2與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子2相互作用共同調(diào)節(jié)Rho激酶活性，而下調(diào)RASAL2表達(dá)則會導(dǎo)致星形細(xì)胞瘤的惡性轉(zhuǎn)化。在卵巢癌的研究中，HUANG等[6]同樣發(fā)現(xiàn)RASAL2在腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且與卵巢癌的臨床分期及病理分型相關(guān)，而RASAL2敲除后能通過活化大鼠肉瘤-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路引起卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。相似的研究結(jié)果也在肺癌中被報(bào)道[7]。值得注意的是，最新研究發(fā)現(xiàn)RASAL2在三陰性乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，且其通過激活Rac1來促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)進(jìn)程，而這種效應(yīng)并不依賴于Ras GAP酶的催化活性[16]。提示RASAL2在腫瘤中的作用可能與細(xì)胞類型及發(fā)育背景相關(guān)。

目前國內(nèi)外尚未見RASAL2在結(jié)腸癌中的研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，RASAL2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織明顯減少，提示在結(jié)腸癌中RASAL2的活性受到抑制。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)RASAL2蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌的Dukes分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示RASAL2可能在結(jié)腸癌的進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，這與上述研究結(jié)果相似。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)RASAL2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤進(jìn)展及浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，其中浸潤轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的重要因素。因此，RASAL2也可能成為結(jié)腸癌的一個預(yù)后判斷指標(biāo)，指導(dǎo)患者的預(yù)后生存。但目前RASAL2在腫瘤中所扮演的角色及調(diào)控機(jī)制還不完全清楚，其在結(jié)腸癌中的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Clinicopathological significance of expression of Ras protein activator like 2 in colon cancer

Zhen LIAO,Hui NING,Wei LIU,Wei LU
(Department of General and Thoracic Surgery,Central Hospital of Laifeng County,Enshi,Hubei 445700,P.R.China)

【Objective】To evaluate the expression of Ras protein activator like 2(RASAL2)in human colon carcinoma and the corresponding adjacent non-tumor tissues,and to explore the correlation between RASAL2 expression and clinicopathologic characteristics of colon carcinoma.【Methods】The expressions of RASAL2 mRNA and protein in the tumor tissues of 42 cases with colon carcinoma and the corresponding adjacent non-tumor tissues were detected by quantitative real-time PCR,Western blot and immunohistochemistry.The correlation between RASAL2 expression and clinicopathologic characteristics of colon carcinoma was then analyzed.【Results】Quantitative real-time PCR and Western blot analysis showed that the expressions of RASAL2 mRNA and protein in the colon carcinoma tissues were notably lower than those in the corresponding adjacent non-tumor tissues(P＜0.05).Immunohistochemical staining demonstrated that the positive rate of RASAL2 protein expression in the colon carcinoma tissues was significantly lower than that in the adjacent non-tumor tissues(42.9％vs 88.1％;χ2=19.012,P＜0.01),and the expression level of RASAL2 was closely correlated with Dukes stage,invasive depth and lymph node metastasis(P＜0.05).【Conclusions】RASAL2 is down-regulated in colon carcinoma tissues;and it may be involved in the carcinogenesis,development and metastasis of colon carcinoma.

RASAL2;colon cancer;qRT-PCR;Western blot;immunohistochemistry

R735.35

A

1005-8982（2015）35-0043-005

2015-06-30

蘆偉，E-mail：weilu_18@163.com