施氏鱘腫嘴病快速檢測方法的研究*

劉雙鳳 鄒作宇 袁美云 董宏偉 呂延玲(哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)分院，哈爾濱150028)

施氏鱘腫嘴病快速檢測方法的研究*

劉雙鳳 鄒作宇 袁美云 董宏偉 呂延玲
(哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)分院，哈爾濱150028)

以施氏鱘(Acipenserschrenckii)腫嘴病病原菌異常嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)為抗原，免疫兔獲得高免血清，建立一種快速檢測施氏鱘腫嘴病病原菌的ELISA技術(shù)。結(jié)果顯示:采用棋盤滴定法確定抗原和抗血清的最適工作濃度分別是為107CFU和1∶100000;病原菌檢測靈敏度為每孔104CFU;抗血清與其它細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的交叉反應(yīng)均呈陰性;阻斷試驗(yàn)中的阻斷率達(dá)67.3%;交叉反應(yīng)和阻斷試驗(yàn)的結(jié)果表明該方法具有較高的特異性。將此方法標(biāo)準(zhǔn)化后，對35份人工感染后的施氏鱘和健康施氏鱘進(jìn)行檢測，陽性的檢出率分別為88.6%和14.3%，表明該技術(shù)不但可以檢測已經(jīng)發(fā)病的施氏鱘，而且還可以檢測帶菌的施氏鱘。

施氏鱘;腫嘴病;異常嗜糖氣單胞菌;間接ELISA

施氏鱘(Acipenserschrenchii)屬于鱘形目，鱘科，鱘屬，主要分布在黑龍江省，具有獨(dú)特的食用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和良好的繁殖性能，是中國鱘魚的主要養(yǎng)殖品種之一。近年來由于其人工養(yǎng)殖技術(shù)迅速的發(fā)展，黑龍江、北京、遼寧、湖北、廣東、江西、貴州、重慶等許多省市成功地開展了鱘魚人工養(yǎng)殖［1］。隨著鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，密度增加，施氏鱘魚頻繁暴發(fā)大規(guī)模的疾病。其中，細(xì)菌性敗血癥、腸炎、腫嘴病最為突出，已嚴(yán)重影響到鱘魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［2］。細(xì)菌性腫嘴病癥狀主要表現(xiàn)在在病魚口部四周充血、腫脹，不能活動(dòng)，攝食困難，口部和體表伴有水霉著生，肛門紅腫，剖檢后發(fā)現(xiàn)在腸道內(nèi)少量食物或無食物，肝腫大。該病在20cm以下的幼鱘階段發(fā)生較多，可造成幼鱘死亡。該病傳播速度快、流行廣、經(jīng)濟(jì)損失較重。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離出該病病原菌并通過人工感染試驗(yàn)證明，即為施氏鱘魚腫嘴病病原菌。對該病原進(jìn)行生理生化鑒定和16srRNA基因序列同源性分析，確定為氣單胞菌屬中的異常嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)。

在魚類的致病菌中，氣單胞菌是主要的致病菌之一。其中，嗜水氣單胞菌［3－5］、維氏氣單胞菌［6］、豚鼠氣單胞菌［7］均可感染鱘魚引起疾病的發(fā)生，給鱘魚養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以施氏鱘腫嘴病病原菌異常嗜糖氣單胞菌為研究對象，建立間接ELISA檢測技術(shù)，以期為養(yǎng)殖鱘魚腫嘴病的快速檢測提供可以使用的方法，并為開發(fā)診斷該病的試劑盒提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用菌株——試驗(yàn)用菌分離于患腫嘴病施氏鱘并鑒定。遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、大腸肝菌(Escherichiacoli)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)由大連水產(chǎn)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

試驗(yàn)動(dòng)物——純種新西蘭白兔購于哈爾濱羅來生物科技發(fā)展有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物事業(yè)部;回歸感染試驗(yàn)用的施氏鱘魚由哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)分院提供。

試驗(yàn)試劑——免疫用弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購于美國Sigma公司;酶標(biāo)抗體、兔陰性血清購自北京Solarbio科技公司，工作濃度為1∶1000。

1.2 抗原的制備

試驗(yàn)方法參照樊景鳳［8］，將異常嗜糖氣單胞菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h后，用無菌的生理鹽水清洗脫、離心、洗滌后，加入甲醛溶液滅活，(終濃度達(dá)0.5%)。24h后，運(yùn)用菌落計(jì)數(shù)法檢測滅菌效果。離心機(jī)4000r/min離心5min后，去掉上清液，用滅菌的生理鹽水洗滌3次后，用顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)菌數(shù)，配制出濃度約為1× 108CFU/mL的菌懸液作為免疫家兔的抗原。弗氏佐劑與菌懸液1∶1比例混合，用兩只注射器分別吸入相同體積的弗氏佐劑與菌懸液，無菌操作用無菌軟件管連接后反復(fù)推拉，最后液體變成油包乳狀后(滴到水里不散開即可)，抗原制備完成。

1.3 抗血清的制備

選擇2只1.5kg左右的健康新西蘭未孕雌兔，背部皮下6點(diǎn)注射免疫，分4次免疫，免疫間隔周期為7d，最后一次免疫7d后，耳靜脈采血，析出血清后，用試管凝集法測定抗體的效價(jià)及交叉反應(yīng)的效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1∶1280以上即可使用。有交叉反應(yīng)的菌株，在免疫的血清中加入過量的該菌細(xì)胞，混合均勻后，冰箱里4℃過夜，再用離心機(jī)離心、過濾除掉該菌。過濾后的血清經(jīng)過交叉反應(yīng)測定后如無交叉反應(yīng)，即可以分裝，保存于－20℃冰箱中備用。

1.4 間接ELISA方法的建立

1.4.1 間接ELISA檢測程序步驟

用pH9.6的碳酸鹽緩沖液(PBS)稀釋異常嗜糖氣單胞菌抗原，加入96孔聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板的孔內(nèi)，100μL/孔，干燥箱60℃烘干;用PBST緩沖液洗滌3次后;每孔加入5%脫脂乳－PBST封閉液，300μL/孔，37℃培養(yǎng)箱中封閉1h;洗滌3次;加入適當(dāng)稀釋的陽性血清和陰性血清，100μL/孔，37℃培養(yǎng)箱中孵育1h;洗滌3次;加入羊抗兔IgG－HRP酶標(biāo)抗體，100μL/孔，37℃培養(yǎng)箱中孵育1h;洗滌3次;加新配制的OPD－H2O2底物溶液，100μL/孔，37℃培養(yǎng)箱中避光孵育10min;加入2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，50μL/孔;10min后用酶標(biāo)儀OD492下讀值，進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4.2 確定抗原和抗體最適工作濃度

采用棋盤滴定法，具體過程如下:將108CFU/mL的異常嗜糖氣單胞菌懸液從1∶10至1∶10000做倍比稀釋，每個(gè)稀釋度包被2孔，100μL/孔;干燥箱60℃烘干;把陽性血清按1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶20000、1∶25000、1∶30000進(jìn)行稀釋，按與抗原濃度變化垂直的方向加入各個(gè)板孔，100μL/孔，培養(yǎng)箱37℃放置1h;酶標(biāo)抗體作1∶1000稀釋，按以上步驟進(jìn)行間接ELISA測定。酶標(biāo)儀讀值，以能產(chǎn)生OD492值1.0左右，且P/N值最大的抗原抗體稀釋度為最佳稀釋度;設(shè)空白對照，加樣順序?yàn)?包被抗原——封閉液——底物。

P/N=(陽性對照OD492值－空白對照OD492值)/(陰性對照OD492值－空白對照OD492值)

1.4.3 免疫血清敏感性試驗(yàn)

將109CFU/mL的異常嗜糖氣單胞菌菌懸液從1∶10至1:1000000做系列稀釋，每個(gè)稀釋度包被2孔(100μL/孔)，干燥箱60℃烘干，將血清稀釋到最適工作濃度后，以確定最小的抗原檢測濃度。酶標(biāo)儀讀值，以產(chǎn)生OD492值接近1.0，且P/N值≥2.1判為陽性。

1.4.4 特異性實(shí)驗(yàn)

交叉實(shí)驗(yàn):用濃度均為107CFU/mL的嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、哈維氏弧菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、豚鼠氣單胞菌包被酶標(biāo)反應(yīng)板，血清采用最適稀釋度，檢測是否有交叉反應(yīng)情況。

阻斷實(shí)驗(yàn):將107CFU/mL的異常嗜糖氣單胞菌菌液包被酶標(biāo)反應(yīng)板，將陽性血清從1∶200開始做倍比稀釋，各稀釋度分別加入等量的異常嗜糖氣單胞菌菌液，混勻后于37℃培養(yǎng)箱中放置1h，同時(shí)對照是不做任何處理的抗異常嗜糖氣單胞菌的陽性血清和陰性血清，進(jìn)行間接ELISA測定，測定其阻斷率。計(jì)算其抑制率的公式為(N－T/N)，N是未經(jīng)處理異常嗜糖氣單胞菌的陽性血清的OD492值，T為經(jīng)過處理的陽性血清的OD492值。

1.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取陽性血清做1∶1000稀釋，隨機(jī)加到酶標(biāo)板孔中，作間接ELISA測定，酶標(biāo)儀讀值后，計(jì)算出平均OD492值與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，之后計(jì)算板內(nèi)變異系數(shù)(CV)，公式如下:CV%=SD/平均OD492值× 100%。然后同樣血清在隨機(jī)5塊板上，做如上重復(fù)測定。然后根據(jù)OD492值，計(jì)算出每份血清的板間變異系數(shù)。

1.5 間接ELISA檢測方法的應(yīng)用

取人工感染試驗(yàn)患腫嘴病的施氏鱘魚及健康施氏鱘魚各35條，解剖后將其肝、腎、嘴等組織用5倍體積的無菌PBS勻漿，離心機(jī)4000r/min，離心后取上清液60℃1h滅活，放4℃冰箱備用。用間接ELISA程序檢測，將離心處理后的上清液直接包被酶標(biāo)板，100μL/孔，2個(gè)平行，以下方法同1.4。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA抗原和抗血清最適工作濃度的確定

不同稀釋度包被抗原與1∶25000稀釋的陽性血清作用所得的OD492值如表1所示，由于抗原在作1∶100稀釋時(shí)OD492值接近1.0，且P/N值最大，所以確定包被抗原的最適工作濃度為107個(gè)/mL。

表1 抗原最適包被濃度的確定

如表2所示，取抗原最適包被濃度1× 107CFU/mL，當(dāng)免疫血清作1∶10000稀釋時(shí)，酶標(biāo)儀讀取的OD492值趨近于1.0同時(shí)P/N值最大，所以確定免疫血清的最適稀釋度為1∶10000。

表2 最適血清工作濃度的確定

2.2 免疫血清敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以最適稀釋度血清(1∶20000)檢測抗原靈敏度，結(jié)果見表3。從表3可見，用間接ELISA測得免疫血清能檢到的異常嗜糖氣單胞菌株最低濃度為104CFU/mL。每孔為103CFU。

表3 免疫血清敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 交叉實(shí)驗(yàn)

檢測金黃色葡萄球菌、遲鈍愛德華氏菌、屈撓桿菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌與抗異常嗜糖氣單胞菌陽性血清交叉反應(yīng)情況，異常嗜糖氣單胞菌作對照，結(jié)果顯示只有異常嗜糖氣單胞菌呈陽性，其余細(xì)菌均呈陰性(表4)。

表4 免疫血清交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 阻斷實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過異常嗜糖氣單胞菌處理過后的陽性血清隨著稀釋度的增加，由表5可看出，OD492值明顯下降，并逐漸接近陰性水平;而未經(jīng)異常嗜糖氣單胞菌處理的陽性血清隨著稀釋度的增加OD492值緩慢下降。阻斷率最高為67.30%，說明該陽性血清對異常嗜糖氣單胞菌具有特異性。

表5 免疫血清阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

板內(nèi)變異系數(shù)(CV)值為0.053，SD=0.0417，平均OD492值為0.7867，CV=5.3%。板間變異系數(shù)(CV)值為0.07998，SD=0.01955，平均OD492值為0.7971，CV=1.955%。板內(nèi)變異系數(shù)和板間變異系數(shù)均小于10%，說明本批次酶標(biāo)反應(yīng)板的吸附性能較好。

2.5 ELISA檢測方法的臨床應(yīng)用

患腫嘴病的施氏鱘進(jìn)行間接ELISA檢測，如果如表6所示，陽性檢出率為88.6%，而健康施氏鱘魚的陽性檢出率為14.3%。

表6 施氏鱘魚的間接ELISA檢測結(jié)果

3 討論

在施氏鱘幼魚養(yǎng)殖過程中，主要發(fā)生的細(xì)菌性疾病有四種，即細(xì)菌性敗血癥、腸炎病、腫嘴病、爛鰓?。?］。其中，由于細(xì)菌性腫嘴病與敗血癥、腸炎病在疾病發(fā)生初期魚體外觀上的病癥表現(xiàn)相似，不易區(qū)分，但致病菌卻不同，因此更需要對施氏鱘魚腫嘴病進(jìn)期早期診斷，準(zhǔn)確判斷病原菌，并進(jìn)行相應(yīng)的抗菌治療，以免因誤診而帶來不必要的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的魚類疾病診斷方法主要是從魚患病處分離疑似致病菌，并對該細(xì)菌(有可能是幾種)的形態(tài)特征、生理生化特征等進(jìn)行分析，需要時(shí)間長且工作量大，目前已經(jīng)不能滿足鱘魚疾病防治的需要，而PCR技術(shù)雖然具有特異性好、檢測速度快且靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但是費(fèi)用較為昂貴，對人員的實(shí)驗(yàn)技能要求較高，同時(shí)所選基因的特異性與重復(fù)性也受到主觀因素的影響，不太適于基層和臨床中的病原快速鑒定，所以限制了該方法在實(shí)際中的應(yīng)用。因此，建立準(zhǔn)確、靈敏、快速的診斷方法很有必要［10］。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme LinkedImmunosorbentAssay，簡稱ELISA)是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)及酶對底物的高效催化反應(yīng)作用相結(jié)合敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作方便、可重復(fù)性強(qiáng)、等優(yōu)點(diǎn)，比較常用的是ELISA雙抗體夾心法和ELISA間接法，經(jīng)常被應(yīng)用于水產(chǎn)病害檢測、診斷等方面，目前嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、溶藻弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌等水產(chǎn)病原菌［11－15］已建立了間接ELISA檢測技術(shù)，但是施氏鱘腫嘴病的間接ELISA檢測方法在國內(nèi)尚屬首次報(bào)道。本方法的建立對于施氏鱘魚腫嘴病的早期診斷，有效預(yù)防疾病發(fā)生，降低養(yǎng)殖成本有著重要意義。

在鰻鱺病魚中分離到了該菌——異常嗜糖氣單胞菌［16］，導(dǎo)致鰻鱺爛尾、腹腔腫大，解剖后肝腎充血腫大而死亡，且人工感染試驗(yàn)死亡率達(dá)到100%。本研究表明此菌在施氏鱘中是首次分離得到，感染試驗(yàn)結(jié)果表明該菌可造成施氏鱘魚腫嘴病的發(fā)生。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)給予一定的重視。

將該方法流程確定各種準(zhǔn)確的參數(shù)后，對健康施氏鱘和人工感染腫嘴病并發(fā)病的施氏鱘進(jìn)行檢測，陽性檢出率分別為14.3%和88.6%，表明該技術(shù)能夠較好的檢測已經(jīng)被異常嗜糖氣單胞菌感染發(fā)生腫嘴病的施氏鱘，也能夠檢測沒發(fā)病但是攜帶致病菌的施氏鱘，這對于鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的早期診斷有著重要意義。本研究所建立的鱘魚腫嘴病間接ELISA技術(shù)具有特異、快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，為施氏鱘幼魚養(yǎng)殖過程中腫嘴病病原菌的檢測提供快速準(zhǔn)確的檢測方法，并為施氏鱘腫嘴病病原菌的ELISA快速檢測試劑盒的研制提供科學(xué)依據(jù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用意義，對進(jìn)一步制定該病的防治方法具有重要的指導(dǎo)意義。

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S941.42

A

1006－3188(2015)01－0003－06

2015－03－18

哈爾濱市科技局青年科技創(chuàng)新人才(2012RFQYN028)

劉雙鳳(1980－)，女，助理工程師，碩士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖及水產(chǎn)動(dòng)物疾病方面的研究。E－mail:47817941@qq.com