子宮內(nèi)膜異位癥動物模型建立方法

陳元歡，武權(quán)生，周小靜，蔡爽，喬新穎

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)指子宮腔內(nèi)具有活性的內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔以外的部位，發(fā)病率高達10%～15%，復(fù)發(fā)率高，并有逐漸增加的趨勢，且存在一定的惡變率，多見于育齡期女性[1-2]。EMT異位病灶的形態(tài)及組織特點隨月經(jīng)周期的變化而變化，因此EMT的主要臨床表現(xiàn)為周期性的下腹部墜脹疼痛，且進行性加重，偶爾伴有肛門下墜感、性交痛及月經(jīng)紊亂，嚴(yán)重者可導(dǎo)致不孕，影響患者的生活質(zhì)量及生理、心理健康。目前，臨床多采用激素類藥物治療EMT，治療周期長且副作用大，如達那唑可導(dǎo)致痤瘡、體重增加和毛發(fā)增多等；促性腺激素釋放激素類藥物可引發(fā)低雌激素癥狀(如潮熱、陰道干燥和性欲減退)，較難根治。因此，明確EMT的病因、病機是研究的主要目標(biāo)，對指導(dǎo)臨床治療有重要意義，而構(gòu)建EMT動物模型是相關(guān)研究的基礎(chǔ)。

Jacoson于1922年首次用兔子成功建立了EMT動物模型[3]，但由于兔沒有規(guī)律的動情期，故此項研究對臨床的指導(dǎo)意義存在爭議；隨著相關(guān)研究的不斷探索發(fā)現(xiàn)，大鼠與人類基因譜較接近[4]，故可將大鼠作為主要的實驗類研究對象。1998年Vernon和Wilson借助自體移植法成功建立了EMT大鼠模型[5]，此后國內(nèi)外學(xué)者不斷探索豐富了各種建模方法，包括自發(fā)性、誘發(fā)性以及種植性等方法?，F(xiàn)就EMT動物模型建立方法進行綜述，以期明確各種不同造模方法的潛力與局限，為造模方法的合理選擇提供參考。

1 自發(fā)性動物模型

1.1靈長類自發(fā)性動物模型 MacKenzie和Casey[6]在尸檢獼猴時發(fā)現(xiàn)，獼猴盆腔內(nèi)存在充滿灰色或巧克力色液體的囊腫，之后D′Hooghe等[7]使用腹腔鏡首次發(fā)現(xiàn)懷孕期間的狒狒可自發(fā)EMT，且隨后的研究發(fā)現(xiàn)，約27%的狒狒患有EMT[8]。Eva Gruber-Dujardin等[9]借助自發(fā)性恒河猴EMT動物模型，對其異位子宮內(nèi)膜病灶的解剖分布、大體形態(tài)、組織學(xué)分化、免疫組織化學(xué)等進行詳細(xì)的研究發(fā)現(xiàn)，非人靈長類動物發(fā)生EMT的發(fā)病部位及病理學(xué)組織結(jié)構(gòu)特征與人類相近。國外研究報道，非人靈長類動物的EMT發(fā)病率高于人類[10-11]。EMT的發(fā)病機制尚不明確，其相關(guān)假說包括經(jīng)血逆流學(xué)說、在位內(nèi)膜決定論等，其中經(jīng)血逆流學(xué)說在EMT的發(fā)病中具有至關(guān)重要的作用，月經(jīng)和EMT僅自然發(fā)生于部分女性和非人靈長類動物中，使構(gòu)建非人靈長類動物模型成為研究EMT病因、發(fā)病機制及治療方法的主要手段，但EMT動物模型的成模率低，研究周期長，需要極大的人力、物力，且定期檢查對動物造成一定的創(chuàng)傷，可能影響實驗結(jié)果，因此該造模方法較難應(yīng)用于實驗研究中。

1.2K-ras基因激活小鼠模型 K-ras是一類原癌基因，可通過點突變的方式激活，EMT的惡變與K-ras基因的激活有一定相關(guān)性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，K-ras 4B基因在EMT患者在位內(nèi)膜中表達增加，K-ras 4A于增殖期在EMT患者在位內(nèi)膜組織中表達，高于非EMT患者[13]。Dinulescu等[14]將表達Cre重組酶的重組腺病毒載體注射到loxP-Stop-loxP-K-rasG12D/+(LSL-K-rasG12D/+)小鼠卵巢囊中，以激活致癌K-ras基因，注射8個月后，除卵巢發(fā)生子宮內(nèi)膜樣變外，47%的小鼠同時發(fā)生了腹膜EMT，病變子宮內(nèi)膜異位腺內(nèi)的上皮細(xì)胞被Cre介導(dǎo)發(fā)生K-ras激活，病灶發(fā)生的潛伏期較長、發(fā)生率低。因此，該動物模型的EMT雖為自發(fā)性，但目前并無K-ras基因突變導(dǎo)致EMT發(fā)病的報道，故該模型的研究對EMT病因及發(fā)病機制的研究無指導(dǎo)意義，僅可用于對EMT形態(tài)學(xué)的觀察及新治療方法的研究。

2 誘發(fā)性動物模型

2.1單純重復(fù)婦科手術(shù)操作 Sampson提出了EMT病因的種植學(xué)說[15]，指出具有活性的子宮內(nèi)膜組織可經(jīng)輸卵管逆流至其他部位，并因引力作用種植于該部位，當(dāng)手術(shù)治療時，可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜腹腔或盆腔種植，亦可造成EMT。Harirchian等[16]通過對實驗動物重復(fù)進行診斷性刮宮及腹腔鏡操作，構(gòu)建了EMT狒狒模型，內(nèi)膜種植1個月后即可在腹腔鏡下觀察到EMT病灶，且手術(shù)切除術(shù)后的EMT復(fù)發(fā)率為75%。上述EMT動物模型與人類EMT的病因及發(fā)病機制部分相似，但發(fā)病周期較自發(fā)性動物模型短、成模率較高，且通過腹腔鏡觀察成模情況，對動物創(chuàng)傷較小，是較理想的造模方法，但該方法對實驗動物的要求較高，所需實驗動物需有規(guī)律月經(jīng)周期，但滿足條件的實驗動物有限，飼養(yǎng)要求高，導(dǎo)致實驗成本升高。

2.2經(jīng)血逆流法 朗景和[17]在子宮內(nèi)膜種植學(xué)說基礎(chǔ)上進一步補充說明，提出了“在位內(nèi)膜決定論”，闡述了在位內(nèi)膜的分子生物學(xué)特點，即異位內(nèi)膜通過黏附、侵襲和血管形成，最終發(fā)展為異位病灶，這是EMT發(fā)生的決定因素。以“子宮內(nèi)膜種植學(xué)說”和“在位內(nèi)膜決定論”為理論指導(dǎo)復(fù)制EMT動物模型，根據(jù)實驗動物有無規(guī)律陰道出血，造模方法分為宮頸環(huán)扎術(shù)和子宮內(nèi)膜逆流法。

2.2.1閉鎖宮頸口 閉鎖宮頸口可用于有規(guī)律月經(jīng)的一類實驗動物，D′Hooghe等[18]借助硅膠、電凝及結(jié)扎等方法閉鎖宮頸口，構(gòu)建EMT狒狒模型；李舒婷等[19]借助宮頸環(huán)扎術(shù)成功構(gòu)建EMT食蟹猴模型，通過慕絲林宮頸環(huán)扎帶的穿刺針穿過子宮的無血管區(qū)完成宮頸環(huán)扎術(shù)，使食蟹猴的月經(jīng)血不能從陰道流出，而經(jīng)輸卵管流至腹腔，符合經(jīng)血逆流學(xué)說，并通過觀察舌面舌底血液灌注量探討舌象變換與證型的相關(guān)性。非人靈長類動物生殖生理特性與人相似，上述方法通過堵塞宮頸促進經(jīng)血逆流建立模型，對臨床具有指導(dǎo)意義；但該造模方法的EMT發(fā)病原因局限，僅適用于研究EMT的發(fā)病機制、組織形態(tài)及治療，且所選實驗動物需有規(guī)律的內(nèi)膜剝脫出血現(xiàn)象，目前用于EMT研究的動物中僅有非人靈長類動物具有這一特征，而非人靈長類動物多為保護級動物，數(shù)量有限且飼養(yǎng)要求高，因此此類造模方法并不能推廣。

2.2.2子宮內(nèi)膜逆流法 子宮內(nèi)膜逆流法可用于無規(guī)律子宮出血動物的EMT模型建立，如兔、大鼠、小鼠，王哲和路芳[20]通過此法成功構(gòu)建EMT Wistar大鼠模型，于子宮近輸卵管端作縱向切口，隨后反復(fù)搔刮子宮切口并使用0.9%氯化鈉溶液向盆腔沖洗內(nèi)膜組織，模擬人因反復(fù)宮腔操作導(dǎo)致EMT發(fā)病的過程，成模率70%。子宮內(nèi)膜逆流法操作簡單，同時嚙齒類動物來源廣泛、飼養(yǎng)簡單、實驗成本低、復(fù)制方便，與通過手術(shù)移植構(gòu)建EMT模型的方法相比，減少了因手術(shù)因素導(dǎo)致的差異；但是，子宮內(nèi)膜逆流法的成模率較手術(shù)移植方法低，實驗周期較手術(shù)移植構(gòu)建EMT模型長，且反復(fù)手術(shù)操作對實驗動物的創(chuàng)傷較大，存在動物不能耐受以及感染發(fā)生風(fēng)險高的不足[20]。

2.3藥物誘導(dǎo)法 Eskenazi等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，EMT的發(fā)病率與環(huán)境中二英濃度呈正相關(guān)。Rier等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，二英的慢性暴露與獼猴EMT的發(fā)生率有關(guān)，認(rèn)為EMT模型也可通過藥物誘導(dǎo)獲得。張靜怡[23]通過米索前列醇成功誘導(dǎo)了恒河猴的子宮腺肌癥，即將一定量米索前列醇與0.9%氯化鈉溶液混合，連續(xù)6個月同一時間經(jīng)陰道注入陰道后穹窿處，并保證無藥物從陰道流出。藥物誘導(dǎo)法可避免手術(shù)操作中炎癥因素對實驗結(jié)果的影響，可針對性地研究EMT的病因及發(fā)病機制；但通過藥物誘導(dǎo)建立EMT動物模型的研究較少，由于實驗過程中可能出現(xiàn)的問題及風(fēng)險無法預(yù)料，且無明顯原因發(fā)生EMT的患者較多，此法EMT模型可能影響實驗動物的內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)，故對EMT患者的臨床指導(dǎo)意義較??；同時，建模周期長，且需開腹探查明確異位內(nèi)膜組織的形成，以上均限制了其應(yīng)用。

2.4手術(shù)移植法

2.4.1自體移植法 Vernon和Wilson[5]首次通過自體移植法成功建立EMT大鼠模型，隨后該方法被不斷完善，成為構(gòu)建EMT動物模型的常用方法。自體移植法包括子宮組織塊移植和子宮內(nèi)膜移植，與子宮組織塊移植相比，子宮內(nèi)膜移植較少發(fā)生粘連[24]，因此，近年來多將子宮碎片的肌層與內(nèi)膜分離，將分離的子宮內(nèi)膜組織通過不同方法置于腹腔內(nèi)不同部位或皮下：①腹腔內(nèi)移植法[25-30]：利用可吸收縫線將分離的內(nèi)膜組織縫合于腹腔內(nèi)不同部位，如腹壁、腸系膜、腸壁等部位；②腹腔內(nèi)注射法[31-32]：將剝離好的內(nèi)膜組織剪成0.5 mm×0.5 mm的碎片，經(jīng)左下腹注入腹腔；③皮下移植法[33-34]：將分離好的子宮內(nèi)膜組織置入腹肌與皮下筋膜層之間；④皮下注射法[35-36]：用注射器將含有子宮內(nèi)膜碎片的0.9%氯化鈉溶液注射至盡量遠(yuǎn)離腹壁切口處的皮下。上述方法中使用的子宮內(nèi)膜組織均取自實驗大鼠自身的子宮，不存在免疫排斥反應(yīng)，可觀察EMT的免疫發(fā)病機制及藥物治療作用。

與腹腔內(nèi)注射法、皮下移植法及皮下注射法相比，腹腔內(nèi)移植法使用較多，技術(shù)更成熟，且定位準(zhǔn)確、成模率高，腹壁、骶韌帶等EMT好發(fā)部位均可移植成功，但將內(nèi)膜與欲移植部位縫合可能引發(fā)炎癥，造成盆腔粘連，病灶周圍病理形態(tài)改變，影響對病灶的觀察和測量，從而影響實驗結(jié)果。而腹腔內(nèi)注射法與皮下注射法避免了這一缺點，更符合子宮內(nèi)膜的自然黏附原則，同時可更直觀地觀察病灶發(fā)生發(fā)展的過程；但腹腔注射法易增加臟器浸潤的機會，皮下注射法因組織塊較小、生長緩慢，故兩法成模率均不高，且注射的含有內(nèi)膜的0.9%氯化鈉溶液濃度較難統(tǒng)一，易存在誤差。皮下移植法與皮下注射法均符合種植學(xué)說，與女性EMT的發(fā)病更為接近，且操作簡單，避免了內(nèi)膜縫合，但移植后實驗動物需腹腔注射雌激素，以促進內(nèi)膜黏附，若實驗?zāi)康呐c激素有關(guān)，此法不適用。

2.4.2同種異體移植法 同種異體移植法是指將同系實驗動物的內(nèi)膜組織進行異體移植。張薇等[37]發(fā)現(xiàn)，同種異體Wistar大鼠EMT模型的成模率略高于自體移植成模率。崔金秀[38]通過皮下移植法成功構(gòu)建大鼠同種異體EMT模型，成模率為66.7%。崔陽陽等[39]通過“腹腔+皮下”注射法成功構(gòu)建EMT KM大鼠模型，除內(nèi)膜組織來源不同外，其余方法均與自體移植法相同，不僅避免了對實驗動物子宮完整性的破壞，且避免了腹腔手術(shù)操作，減少了手術(shù)及異物對盆腔微環(huán)境的影響，故該方法簡單易重復(fù)，對受體小鼠的創(chuàng)傷小，降低了因感染或反復(fù)手術(shù)操作導(dǎo)致的死亡率。但同種異體移植法在EMT動物模型構(gòu)建中的使用較少，實驗動物對同種屬來源的異位子宮內(nèi)膜免疫排斥的程度以及是否影響成模率尚不清楚。

2.5宮腔開放法 哈春芳等[40]通過宮腔開方法成功構(gòu)建了EMT Wistar大鼠模型，即將實驗大鼠子宮內(nèi)膜面縫合至子宮骶韌帶及大網(wǎng)膜血運豐富處，成模率(81.08%)與傳統(tǒng)方法成模率(83.78%)差異較小，且肉眼所見病灶多以粘連為主，局部可見炎癥細(xì)胞浸潤。宮腔開放法充分利用炎癥誘導(dǎo)的腹腔內(nèi)環(huán)境建立EMT模型，與EMT雌激素依賴性炎癥性疾病的特征較為相似，且內(nèi)膜組織與盆腔的接觸面較大，便于取材、觀察；與傳統(tǒng)移植法相比，宮腔開放法不需要制備移植物，操作簡單，成模率與自體移植法無明顯差異，是較理想的EMT方法。但該方法使用較少，且相關(guān)實驗研究少，對實驗結(jié)果的不良影響亦不明確。

3 種植法動物模型

種植法又稱異種異體移植法[41]，即將人的異位內(nèi)膜組織種植于實驗動物體內(nèi)，主要移植方法包括①增殖期/分泌期內(nèi)膜移植；②人在位內(nèi)膜/異位內(nèi)膜/蛻膜組織等不同來源移植物移植，Stocks 等[42]手術(shù)切除裸鼠卵巢，皮下植入緩釋雌二醇膠囊，將人子宮內(nèi)膜組織片段注入裸鼠腹腔，成功建立人源性裸鼠EMT模型；③純化不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞種植；④人免疫功能重建EMT模型。

與其他方法相比，異種異體移植法保留了人異位內(nèi)膜的組織形態(tài)及生物特性，使病灶的病理改變與人體更為接近，且對藥物的反應(yīng)無變化，因此對研究 EMT的發(fā)病機制及治療具有重要意義；但此法仍存在不足：①對實驗動物的要求較高，目前僅免疫缺陷小鼠符合要求，對手術(shù)耐受性較小，多次手術(shù)操作易造成小鼠死亡；②由于實驗小鼠存在免疫缺陷，故不能用于免疫因素與EMT關(guān)系的研究；③移植物存活時間短，后續(xù)研究的開展時間受限；④免疫缺陷小鼠存在免疫功能缺陷，影響腹腔液中的細(xì)胞因子，不能應(yīng)用于EMT免疫學(xué)機制的研究；⑤將人的內(nèi)膜組織用于實驗研究不符合倫理要求，限制了此方法的推廣。

4 小 結(jié)

成功構(gòu)建EMT動物模型是EMT研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而成功的EMT動物模型不僅需要完全復(fù)制EMT的病理特征，還應(yīng)考慮EMT的發(fā)病原因與機制。同時，應(yīng)考慮動物實驗研究的可行性及成本、周期及成功率。因此，應(yīng)根據(jù)研究目的、實驗室條件、經(jīng)濟能力等，結(jié)合不同動物模型的優(yōu)缺點綜合考慮，選擇合適的模型，對EMT的病因及發(fā)病機制進行探討，并發(fā)現(xiàn)EMT低復(fù)發(fā)率及較少不良反應(yīng)的治療手段。自體移植法、經(jīng)血逆流法及藥物誘導(dǎo)法均需使用狒狒等保護動物進行實驗，故較難推廣；種植性動物模型需要人異位內(nèi)膜組織，違反了倫理要求，也不能用于實驗研究；各種手術(shù)移植法存在不同的缺陷，但使用廣泛，且在不斷完善，是未來建立EMT動物模型的主要方法。