蝦蛄多肽酶解工藝的優(yōu)化及其體外免疫活性研究

卜天　馬劍茵

摘要[目的] 研究蝦蛄多肽的免疫活性。[方法] 采用胰蛋白酶水解蝦蛄的生物組織，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探索其最佳酶解條件，采用MTT試驗(yàn)研究蝦蛄多肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性，并通過中性紅吞噬試驗(yàn)分析蝦蛄多肽的免疫調(diào)節(jié)能力。[結(jié)果] 蝦蛄多肽的最佳酶解條件為：溫度62.5 ℃、pH 9.5、酶解時(shí)間8 h、加酶量0.08%，此時(shí)蝦蛄多肽對(duì)RAW264.7有最高的細(xì)胞活性，并對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。[結(jié)論] 該研究為從海洋蛋白中獲取高生物活性的酶解產(chǎn)物和具有免疫活性的多肽提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞蝦蛄多肽；胰蛋白酶；酶解條件；免疫活性

中圖分類號(hào)S917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）07-139-02

蝦蛄（Oratosquilla oratoria）隸屬節(jié)肢動(dòng)物門[1]、甲殼綱、軟甲亞綱、口足目、蝦蛄科口蝦蛄屬，又名皮皮蝦、東方蝦蛄、富貴蝦、瀨尿蝦等，廣泛分布在我國、日本以及東南亞的沿海地區(qū)。我國南北沿海等地均有大量生產(chǎn)。蝦蛄肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，物美價(jià)廉，深受消費(fèi)者喜愛。從海洋生物中提取到的多肽，其功能活性主要集中在抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制胰島細(xì)胞凋亡及改善胰島素抵抗、降血壓、降血脂、增強(qiáng)骨質(zhì)強(qiáng)度及預(yù)防骨質(zhì)疏松、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及抗血管生成等方面[2-5]。目前，關(guān)于蝦蛄藥用價(jià)值的研究有口蝦蛄乙酸乙酯提取物與阿霉素或順鉑聯(lián)合作用對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制[6]，口蝦蛄提取物對(duì)人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2的遷移及體外血管生成擬態(tài)的抑制作用[7]等。有關(guān)蝦蛄的研究中大多是提取其酶解液進(jìn)行腫瘤抑制試驗(yàn)，然而關(guān)于蝦蛄酶解液對(duì)免疫細(xì)胞作用的研究還不多。筆者采用蝦蛄為原料，用胰蛋白酶作為水解酶，以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活性作為多肽活性指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法探討其最佳酶解條件，提取多肽，同時(shí)通過小鼠巨噬細(xì)胞中性紅吞噬試驗(yàn)探索蝦蛄多肽的免疫活性。

1材料與方法

1.1原料與試劑

新鮮蝦蛄采集自浙江省舟山市附近海域；胰蛋白酶（購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉，購自無錫市晶科化工有限公司，分析純；鹽酸（36%～38%），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純；二甲基亞砜（DMSO）、MTT試劑、中性紅試劑，均購自美國Sigma公司。

1.2儀器

DS-1高速組織搗碎機(jī)，為上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品；BS110電子分析天平，為北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；PHS-250精密pH計(jì)，為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SSW-420-2S恒溫水浴鍋，為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司產(chǎn)品。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1

MTT法檢測(cè)蝦蛄多肽對(duì)細(xì)胞活性的影響。取對(duì)數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種至96孔板，每孔200 μl，設(shè)置5個(gè)平行孔，于5% CO2、37 ℃條件下貼壁12 h，置于倒置顯微鏡下觀察，并棄去培養(yǎng)液，同時(shí)將蝦蛄酶解液凍干粉以10 mg/ml溶于培養(yǎng)液中。然后分別加入每個(gè)孔，同時(shí)設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照組，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，加入含有MTT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，離心并去除上清液。每孔加入二甲基亞砜100 μl，并置于搖床上低速振蕩15 min，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長570 nm處測(cè)定各孔的吸光值（A值），以A值大小表示小鼠巨噬細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱[8]。

1.3.2

單因素試驗(yàn)探索酶解工藝條件。用高速組織搗碎機(jī)將蝦蛄組織搗碎勻漿，用緩沖液調(diào)pH，加入胰蛋白酶酶解數(shù)小時(shí)，100 ℃下滅酶15 min，于4 ℃下離心15 min（10 000 r/min）并取上清液，采用MTT法測(cè)定酶解液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活性的影響。采用單因素試驗(yàn)分析酶解溫度、pH、時(shí)間及加酶量對(duì)細(xì)胞活性的影響，并初步確定酶解法制備蝦蛄多肽的工藝條件。

1.3.3

酶解蝦蛄多肽工藝的優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件，并采用MTT法測(cè)測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞活性。

1.3.4

中性紅法檢測(cè)蝦蛄多肽免疫調(diào)節(jié)活性。

取對(duì)數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7制成濃度為106個(gè)/cell的細(xì)胞懸液，接種至96孔板，每孔200 μl，設(shè)5個(gè)平行孔，于5% CO2、37 ℃條件下貼壁3 h，倒置顯微鏡下觀察，棄去培養(yǎng)液，同時(shí)將上述最佳酶解條件下制備的蝦蛄酶解液以梯度濃度分別溶于培養(yǎng)液中，每孔150 μl。另外，設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照組和加入LPS（1 mg/L）擬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的陽性對(duì)照組。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h，每孔再加入0.1%中性紅溶液50 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，終止培養(yǎng)后離心并吸棄上清液，用 PBS 洗滌 3 次，每孔加入 100 μl 細(xì)胞裂解液（乙酸∶無水乙醇=50∶50），4 ℃下靜置過夜，使用酶標(biāo)儀于540 nm處測(cè)定吸光度A值。以A值大小表示巨噬細(xì)胞吞噬功能的強(qiáng)弱[9-10]。以試驗(yàn)組A值與空白組A值的比值表示蝦蛄多肽作用下對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的促進(jìn)率，按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

促進(jìn)率=A試驗(yàn)組/A空白組×100%。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1

溫度對(duì)蝦蛄酶解產(chǎn)物的影響。從圖1可以看出，隨著酶解溫度的增加，小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性（A值）不斷增加，當(dāng)酶解溫度為60 ℃時(shí)A值達(dá)到最大值。

圖1 酶解溫度對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響

2.1.2

pH對(duì)蝦蛄酶解產(chǎn)物的影響。從圖2可以看出，隨著pH的升高，小鼠巨噬細(xì)胞活性不斷增加，并在pH為10時(shí)達(dá)到最大值，此后開始降低。

圖2酶解pH對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響

2.1.3

酶解時(shí)間對(duì)蝦蛄酶解產(chǎn)物的影響。從圖3可以看出，小鼠巨噬細(xì)胞活性（A值）隨著酶解時(shí)間的增長而升高，當(dāng)酶解8 h后A值最大，此后A值隨著酶解時(shí)間的增長而降低。

圖3酶解時(shí)間對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響

2.1.4

加酶量對(duì)蝦蛄酶解產(chǎn)物的影響。從圖4可以看出，隨著加酶量的增長，小鼠巨噬細(xì)胞（A值）不斷降低，當(dāng)加酶量為0.12%時(shí)（A值）最大。

圖4加酶量對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件

由表5可知，各因素對(duì)胰蛋白酶酶解蝦蛄的影響程度依次為溫度>加酶量>pH>時(shí)間。溫度是優(yōu)化條件中影響最大的因素，加酶量次之，而時(shí)間的影響最小。最佳酶解工藝條件為：酶解溫度62.5 ℃，pH為9.5，酶解時(shí)間8 h，加酶量為0.08%。

表5酶解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

序號(hào)時(shí)間pH溫度加酶量吸光值

11（7.5 h）1（9.5）1（57.5 ℃）1（0.08%）1.784

212（20）2（60 ℃）2（0.12%）2.114

313（10.5）3（62.5 ℃）3（0.16%）1.323

42（8 h）1232.344

522312.793

623111.512

73（8.5 h）1322.432

832131.602

933212.245

X11.7402.1871.6332.274

X22.2162.1702.2342.019

X32.0931.6932.2831.756

極差0.4760.4940.6010.518

2.3中性紅吞噬試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，隨著蝦蛄多肽濃度的升高，陽性對(duì)照組及部分試驗(yàn)組的吸光度顯著升高（P<0.05），小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力逐漸增強(qiáng)，說明蝦蛄多肽具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力，但其增強(qiáng)作用低于陽性對(duì)照，即不會(huì)引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

表1小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中性紅吞噬試驗(yàn)結(jié)果（x±S，n=5）

組別濃度∥mg/ml吸光值促進(jìn)率∥%

空白0.092±0.004-

陽性對(duì)照（LPS）0.142±0.015*154

150.099±0.018107

2100.107±0.013116

3150.110±0.004119

4200.116±0.010*126

5250.115±0.008*125

注：*表示與空白對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。

3討論

蝦蛄生長于海洋世界，其多肽的氨基酸結(jié)構(gòu)和組成均有其特殊性，為從海洋生物多肽酶解液中獲得較高生物活性的多肽提供了可能性。筆者采用組織勻漿、酶解、冷凍離心等方法提取蝦蛄活性多肽，中性紅吞噬試驗(yàn)結(jié)果表明蝦蛄經(jīng)過酶解后具有一定的免疫活性。

筆者采用胰蛋白酶對(duì)蝦蛄進(jìn)行酶解，并對(duì)影響多肽酶解過程的各個(gè)因素及水平進(jìn)行綜合分析，酶解最佳條件為酶解溫度62.5 ℃，pH為9.5，酶解時(shí)間8 h，加酶量0.08%。通過MTT試驗(yàn)和小鼠巨噬細(xì)胞中性紅吞噬試驗(yàn)探索了蝦蛄多肽的細(xì)胞活性與免疫活性，試驗(yàn)結(jié)果為更好地使用酶解從海洋蛋白中獲取高生物活性的產(chǎn)物和具有免疫活性的多肽提供了一定的科學(xué)依據(jù)，其免疫活性及其機(jī)制還有待于深入研究。

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