菜籽粕固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶條件的優(yōu)化

廖杰瓊，陳力力,*，楊伊磊,，青文哲，康汝罄

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

菜籽粕是油菜籽榨油后的副產(chǎn)物，含有豐富的粗蛋白、粗纖維、脂肪、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，但由于含有硫代葡萄糖甙等有毒物質(zhì)，其營養(yǎng)價值一直沒有得到很好的利用，僅以很小比例的添加量作為反芻動物和淡水魚養(yǎng)殖的飼料或用作肥料[1–5]。利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵菜籽粕，能有效分解菜籽粕中的抗營養(yǎng)因子，得到納豆激酶。納豆激酶具有較強的纖溶活性，能直接作用于纖溶蛋白，也能激活體內(nèi)纖溶酶原。與其他溶栓類藥物相比，納豆激酶具有安全性好、成本低、纖溶活性強、可口服、作用時間長等優(yōu)點，有望被開發(fā)為新一代的口服抗血栓藥物[6–7]。固態(tài)發(fā)酵是微生物在沒有或基本沒有游離水的固態(tài)基質(zhì)上進行發(fā)酵的方式。與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵具有基質(zhì)簡單、來源廣泛、投資少、技術簡單和產(chǎn)物產(chǎn)率高等優(yōu)點[8–10]，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。筆者以菜籽粕和麩皮為原料，研究微生物固態(tài)發(fā)酵方式產(chǎn)納豆激酶的條件，旨在為利用菜籽粕大規(guī)模生產(chǎn)納豆激酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

菜籽粕由湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術湖南省重點試驗室用水酶法提取油菜籽油后的副產(chǎn)物加工而成(將其干燥、粉碎，過孔徑450 μm 的不銹鋼篩)；麩皮從飼料公司購得。納豆芽孢桿菌U49(Bacillus nattoU49)由湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術湖南省重點實驗室選育。菌種培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基和LB 液體培養(yǎng)基；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基以菜籽粕和麩皮按一定比例配制而成。

1.1.2 主要儀器與試劑

主要儀器為722N 可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)、SW–CJ–2D 雙人單面(垂直)凈化工作臺(江蘇通凈凈化設備有限公司)、ZHWY– C2102 恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)和TP–620A 電子天平(湘儀天平儀器設備有限公司)。

主要試劑凝血酶購自中國藥品生物制品檢定所；尿激酶由麗珠藥業(yè)生產(chǎn)；纖維蛋白原為Sigma產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)、分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化與種子液制備

從納豆芽孢桿菌U49 保藏斜面中取一環(huán)菌苔接種于LB 斜面培養(yǎng)基中，在37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 進行活化，隨后挑取一環(huán)活化的菌種接入裝有30mL LB 肉湯培養(yǎng)基的250mL 三角瓶中，搖勻后在37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，備用。

1.2.2 初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的確定

以菜籽粕和麩皮為基本原料(按質(zhì)量比7∶3 混合)，基本原料中葡萄糖、尿素、氯化鈣的添加濃度分別為0.55、0.40、0.35g/(100g)，初始物料比為95g/(100g)，接種量為10g/(100g)，裝瓶量為10%(采用300mL 三角瓶)，于pH 7.0、37℃下培養(yǎng)48 h。

1.2.3 單因素試驗

在1.2.2 的基礎上，分別以接種量、種齡、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、裝瓶量、初始物料比、初始pH為自變量，在不同條件下進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，以納豆激酶酶活力為考核指標進行單因素試驗。

1.2.4 納豆激酶酶活力的測定

收集適宜發(fā)酵條件下獲得的發(fā)酵產(chǎn)物，用生理鹽水浸提，離心，收集上清液(上清液即為粗酶液)，采用纖維蛋白平板法[11–12]測定納豆激酶酶活力。

1.2.5 Plackett–Burman 試驗

在前期培養(yǎng)基組成優(yōu)化試驗的基礎上，選用N–11 的Plackett–Burman 試驗設計，即以產(chǎn)納豆激酶酶活力為響應值，對接種量、種齡、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、裝瓶量、初始物料比、初始pH 值等7個因素的重要性進行考察，另外取4個虛擬因素，每1個因素取–1 和+12個水平。

1.2.6 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett–Burman 試驗結(jié)果，以各顯著因素的正、負效應確定最陡爬坡試驗[13–15]的變化方向和變化步長，逼近最大響應區(qū)域，找到下一步響應面試驗的中心點，進行最陡爬坡試驗設計。

1.2.7 響應面試驗

綜合爬坡試驗結(jié)果確定重要影響因素的取值區(qū)間，根據(jù)Box–Behnken 中心組成設計原理[16–20]，設計三因素三水平(Design Expert 8.0.3)的三元二次響應面分析試驗，以優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007 對數(shù)據(jù)進行處理。采用Design– Expert 8.0.3 軟件分析Plackett–Burman 試驗、最陡爬坡試驗及響應面試驗的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

在1.2.2 條件下發(fā)酵后的酶活力為3 935.07 IU/g。根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取的產(chǎn)酶各因素的最佳點見表1 中的–1 水平，即最佳接種量為8g/(100g)，種齡為18 h，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為96 h，裝瓶量為6.67%，初始物料比為90g/(100g)，初始pH 為7。

表1 Plackett–Burman試驗設計的因素和水平 Table 1 Factors and levels of Plackett–Burman design

2.2 主效因素的篩選結(jié)果

以納豆激酶酶活力為響應值，N–11 的Plackett– Burman 試驗設計及其結(jié)果見表2。對表2 進行回歸分析的結(jié)果見表3。

表2 Plackett–Burman試驗設計及結(jié)果 Table 2 Schemes and their results of Plackett–Burman design

表3 Plackett–Burman試驗各因素及其影響效果 Table 3 Significance analysis of Plackett–Burman design

由表3 可知，發(fā)酵溫度、初始物料比、發(fā)酵時間、接種量、種齡、初始pH 值、裝瓶量對產(chǎn)納豆激酶的影響依次減小。由模型貢獻率可知，對產(chǎn)酶影響最大的3個因素為發(fā)酵溫度、初始物料比和發(fā)酵時間，其貢獻率分別為59.99、24.05 和5.56，其余因素對結(jié)果影響不大，所以，將這3個因素作為最陡爬坡試驗的主效因素，根據(jù)各因素的效應值確定變化步長，逼近最大響應區(qū)域。

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

由于表3中3個主效因素的效應度均為負值，因此，最陡爬坡試驗各主效因素水平的取值范圍都應以單因素的水平為起點，向逐漸減小方向設計5個水平(表4)。由表4可見，第2組試驗的納豆激酶酶活力最大(5 408.34 IU/g)，所以，選取該組試驗的3個因素為中心組合試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗設計及其結(jié)果 Table 4 Designs and their results of the steepest ascent experiment

2.4 發(fā)酵條件的響應面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗的結(jié)果，以納豆激酶酶活力為響應值，以對納豆激酶產(chǎn)量有顯著影響的因素(發(fā)酵溫度、初始物料比、發(fā)酵時間)為自變量設計中心優(yōu)化組合試驗的因素編碼及水平見表5。中心組合試驗結(jié)果見表6。

表5 中心組合試驗設計的因素和水平 Table 5 Levels and factors of response surface analysis

表6 Box–Behnken試驗設計及試驗結(jié)果 Table 6 Design matrix and their results of Box–Behnken experiment

利用Design Expert 8.0.3對上述試驗結(jié)果進行二次回歸擬合的方程為Y= –72 088.954 25+ 2 791.705 89X1+ 219.570 66X2+ 387.128 39X3–1.009 75 X1X2+ 3.803 30X1X3+ 0.314 73X2X3–42.413 54X12– 1.177 18X22–2.975 90X32。式中，Y為納豆激酶酶活力的預測值；X1、X2、X3分別代表發(fā)酵溫度、初始物料比、發(fā)酵時間的編碼值。

由表7三元二次響應面模型的方差分析結(jié)果可以看出，模型的F=10.72，該回歸方程的決定系數(shù)R2=0.932 3，P=0.002 5＜0.01，模型的回歸項極顯著，但失擬項不顯著，表明該模型在被研究的回歸區(qū)域與實際情況的擬合度良好，失擬較小，預測值和實測值之間具有高度相關性，可用于對納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)納豆激酶進行預測。

表7 二階回歸方程的方差分析結(jié)果 Table 7 Variance analysis for the second order regression equation

由圖1～3可見，過高或過低的初始物料比、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度均不利于酶活力的提高。發(fā)酵溫度對酶活力的影響最明顯。運用Design Expert 軟件對模型進行分析，得到納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度36℃，初始物料比90.24g/(100g)，發(fā)酵時間92.82 h。在此條件下，納豆激酶酶活力預測值為6 031.33 IU/g。

圖1 不同發(fā)酵溫度和初始物料比條件下產(chǎn)納豆激酶的酶活力 Fig.1 Activity of Natto-kinase at various conditions of fermentation temperature and ratio of initial Materials

圖2 不同發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間條件下產(chǎn)納豆激酶的酶活力 Fig.2 Activity of Natto-kinase at various conditions of fermentation temperature and time

圖3 不同發(fā)酵時間和初始物料比條件下產(chǎn)納豆激酶的酶活力 Fig.3 Activity of Natto-kinase at various conditions of fermentation time and ratio of initial materials

3 結(jié)論

采用響應面法對納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得出了產(chǎn)納豆激酶的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度36℃，初始物料比90.24g/(100g)，發(fā)酵時間92.82 h。在此條件下以菜籽粕和麩皮為基礎培養(yǎng)基(按質(zhì)量比7∶3混合)，按0.55、0.40、0.35g/(100g)添加葡萄糖、尿素、氯化鈣，于初始pH 7.0，接種量8g/(100g)發(fā)酵培養(yǎng)納豆芽孢桿菌，所產(chǎn)納豆激酶的酶活力達6 031.33 IU/g，比優(yōu)化前提高了1.55倍。

發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和初始物料比對酶活力的影響依次減小。在一定范圍內(nèi)，隨初始物料比、發(fā)酵時間和溫度的增加，納豆激酶酶活力增加。

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