B族鏈球菌核酸檢測在產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用

黃滿輝張龍繪李珍宇.廣東省東莞市清溪醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東東莞 53660；.廣東省東莞市清溪醫(yī)院檢驗科，廣東東莞 53660

B族鏈球菌核酸檢測在產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用

黃滿輝1張龍繪1李珍宇2
1.廣東省東莞市清溪醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東東莞 523660；2.廣東省東莞市清溪醫(yī)院檢驗科，廣東東莞 523660

[摘要]目的 探討B(tài)族鏈球菌核酸檢測在產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用價值。 方法 選擇2012年7月～2014年6月在我院產(chǎn)科門診進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)檢、單胎宮內(nèi)妊娠、胎兒存活的325例孕婦為研究對象，于孕35～37周取陰道分泌物和肛周分泌物，分別進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)與實時PCR檢測，觀察兩種檢測方法檢出效果，比較B族鏈球菌陽性、陰性對孕產(chǎn)婦妊娠結(jié)局及對新生兒結(jié)局的影響。 結(jié)果 325例孕婦中，B族鏈球菌細(xì)菌培養(yǎng)檢出陽性13例（4%），實時PCR檢測檢出陽性29例（8.92%），特異度為94.9%，靈敏度為100.0%，陽性預(yù)測值為44.8%，陰性預(yù)測值為100.0%；B族鏈球菌陽性孕產(chǎn)婦宮內(nèi)感染（13.79%）、胎膜早破（34.48%）、早產(chǎn)（10.34%）、產(chǎn)后出血（10.34%）均明顯高于GBS陰性孕產(chǎn)婦（P＜0.05）；B族鏈球菌陽性孕產(chǎn)婦所分娩新生兒肺炎（6.9%）、新生兒敗血癥（6.9%）、新生兒窘迫（13.79%）明顯高于GBS陰性所分娩新生兒（P＜0.05）。 結(jié)論妊娠晚期B族鏈球菌攜帶明顯增加了孕產(chǎn)婦宮內(nèi)感染、胎膜早破、早產(chǎn)、產(chǎn)后出血以及新生兒肺炎、新生兒敗血癥、新生兒窘迫發(fā)生率，B組鏈球菌核酸檢測試驗用于產(chǎn)前檢查有著重要的意義。

[關(guān)鍵詞]B族鏈球菌；實時PCR檢測；妊娠結(jié)局；新生兒結(jié)局

B族鏈球菌學(xué)名無乳鏈球菌，是一種革蘭陽性球菌，常寄生于陰道和直腸，是圍產(chǎn)期感染中排在首位的致病菌[1]，可導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒感染，也是孕產(chǎn)婦生殖道感染的重要病菌，易誘發(fā)泌尿道感染、產(chǎn)褥感染以及孕產(chǎn)婦敗血癥、早產(chǎn)，同時也易誘發(fā)新生兒腦膜炎、肺炎、敗血癥。美國疾病控制中心（CDC）報道平均每年約為8000例新生兒感染B族鏈球菌，病死率約為5%，為此制定了B族鏈球菌篩查和處理指南[2-3]，極大降低了圍產(chǎn)期B族鏈球菌的發(fā)生率。我國有關(guān)B族球菌感染的研究較少，少有的報道也提示B族鏈球菌可能是新生兒肺炎死亡的第一位致病菌[4]。傳統(tǒng)的檢測方法是標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)，至少需要24 ～ 48h才能完成，實時PCR檢測整個操作過程只需2～4h，能很好地滿足臨產(chǎn)前檢測的需要[5]。本文選擇325例孕婦為研究對象，分別采用細(xì)菌培養(yǎng)與實時PCR檢測的方法，探討實時PCR檢測的應(yīng)用價值以B族鏈球菌感染對孕產(chǎn)婦和新生兒結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年7月～2014年6月在我院產(chǎn)科門診進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)檢、單胎宮內(nèi)妊娠、胎兒存活的325例孕婦為研究對象，年齡20～35歲，平均（26.5±3.1）歲，其中經(jīng)產(chǎn)婦20例，初產(chǎn)婦305例；孕周32～41周，平均孕周（36.35±4.25）周。所有孕婦近期均無性交以及使用抗生素史，并全部簽署知情同意書。

1.2 方法

參照2002年美國疾病控制中心（CDC）推薦取材方法[6]，于孕35～37周期間對孕婦取材，先用2根消毒棉拭子置入陰道下1/3內(nèi)取陰道分泌物，再用2根消毒棉拭子插入肛門取直腸分泌物，分別用于細(xì)菌培養(yǎng)和實時PCR檢測。

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 取陰道、直腸分泌物放入5%羊血培養(yǎng)基內(nèi)，溫度控制35℃，培養(yǎng)18～24h，取灰白、圓形可疑菌（革蘭氏染色陽性鏈球菌、觸酶實驗陰性）接種培養(yǎng)16h，使用法國生物梅里埃VITEK-2細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.2.2 實時PCR檢測 取陰道、直腸分泌物棉拭子置入1mL無菌清洗液中，室溫下保存，24h檢測。震蕩均勻，并充分?jǐn)D干棉拭子，將全部液體吸入1.5mL離心管內(nèi)，13000r/min，離心分離5min，棄除上清液，加50μL三羥基氨基甲烷-已二胺四乙酸緩沖液重懸，加入10μL內(nèi)參照，加入提取固形物震蕩5min，離心后95℃加熱2min后，立即冰浴5min，高速（13000r/min）離心1min，取上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。對于實時PCR與細(xì)菌培養(yǎng)檢測相異標(biāo)本，采用第2對引物進(jìn)行二次擴(kuò)增測序的方法進(jìn)行校正。實時PCR檢測試劑選用福建泰普生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用頻數(shù)（n）或率（%）表示，采用x2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 325例孕婦B族鏈球菌細(xì)菌培養(yǎng)與實時PCR檢測分析

以細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR檢測結(jié)果對比。對比結(jié)果顯示，325例孕婦中，B族鏈球菌細(xì)菌培養(yǎng)檢出陽性13例（4%，13/325），實時PCR檢測檢出陽性29例（8.92%，29/325）。13例細(xì)菌培養(yǎng)檢出陽性中，實時PCR檢測均為陽性；另外16例細(xì)菌培養(yǎng)陰性患者，進(jìn)行擴(kuò)增測序及結(jié)合臨床進(jìn)展結(jié)果顯示，14例為B族鏈球菌陽性，2例陰性。特異度為94.9%，靈敏度為100.0%，陽性預(yù)測值為44.8%，陰性預(yù)測值為100.0%。見表1。

表1　325例樣本細(xì)菌培養(yǎng)與實時PCR檢測結(jié)果比較

表2　B族鏈球菌陽性與陰性孕產(chǎn)婦的妊娠結(jié)局比較[n（%）]

表3　B族鏈球菌陽性與陰性新生兒結(jié)局比較[n（%）]

2.2 B族鏈球菌陽性對孕婦妊娠結(jié)局的影響

B族鏈球菌陽性患者分娩方式與陰性患者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；GBS陽性孕產(chǎn)婦宮內(nèi)感染（13.79%）、胎膜早破（34.48%）、早產(chǎn)（10.34%）、產(chǎn)后出血（10.34%） 均明顯高于GBS陰性孕產(chǎn)婦（P＜0.05）。見表2。

2.3 B族鏈球菌陽性對新生兒結(jié)局的影響

GBS陽性與陰性孕產(chǎn)婦所分娩新生兒上呼吸道感染比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；GBS陽性孕產(chǎn)婦所分娩新生兒發(fā)生新生兒肺炎（6.9%）、新生兒敗血癥（6.9%）、新生兒窘迫（13.79%）明顯高于GBS陰性所分娩新生兒（P＜0.05）。見表3。

3 討論

B族鏈球菌是一種寄生于泌尿生殖道及消化道的致病菌，不同地區(qū)、不同種族妊娠晚期婦女帶菌率各有不同。1996年美國疾病控制中心（CDC）提出的預(yù)防和控制B族鏈球菌方案得到了美國兒科學(xué)會（AAP）、美國婦產(chǎn)科學(xué)會（ACOG）的認(rèn)可[7]，明確提高對所有孕周為35～37周的孕婦進(jìn)行B族鏈球菌培養(yǎng)，對檢出陽性患者進(jìn)行預(yù)防性治療，據(jù)統(tǒng)計，這種預(yù)防和控制方案可以對26.7%的分娩者進(jìn)行預(yù)防性治療，能夠預(yù)防86%的新生兒發(fā)生B族鏈球菌感染[8]。B族鏈球菌是圍生期最重要的致病菌之一，能夠上行感染胎膜。有文獻(xiàn)研究顯示[9]，在眾多圍生期病原菌中，GBS對于絨毛膜的吸附能力和穿透能力最強，不但會引起細(xì)胞因子及前列腺素的釋放，同時還會造成磷脂酶A2的升高，引發(fā)胎膜張力降低、組織水腫，從而造成胎膜早破及刺激宮縮引起早產(chǎn)。

胎膜早破的產(chǎn)婦往往合并有羊膜腔感染，但這在早期并無明顯癥狀，病理學(xué)上診斷為絨毛膜羊膜炎，屬于亞臨床感染，如果能及時控制，則能夠有效阻斷感染的發(fā)展，改善妊娠結(jié)局。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定時間較長，大約需要24～48h，由于B族鏈球菌具有間歇性與短暫性的特點，而且免疫學(xué)的敏感性與B族鏈球菌含量有關(guān)，常規(guī)35～37孕周鏈球菌培養(yǎng)篩查方法漏診率較大，黃永建等[9]通過對445例妊娠晚期婦女B族鏈球菌細(xì)菌培養(yǎng)與實時PCR檢測方法的比較研究，證實實時PCR檢測方法陽性率明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)陽性率。本文研究結(jié)果表明，325例受檢孕婦中，B族鏈球菌細(xì)菌培養(yǎng)陽性檢出率4%（13/325），實時PCR陽性檢出率8.92%（29/325），通過對細(xì)菌培養(yǎng)與實時PCR檢出相異16例擴(kuò)增測序檢測，14例顯示陽性，2例陰性，實時PCR敏感度100.0%（26/26），特異度99.38% （323/325），提示實時PCR檢測具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的特點，顯示出更高的實用性和優(yōu)越性。從本次結(jié)果來看，熒光實時PCR的敏感性及特異性均較高，符合臨床檢驗需求，但也有學(xué)者研究[10]指出，實時PCR檢驗費用較高是影響該方案普及的一個重要因素，也是影響產(chǎn)前篩查大范圍推廣的一個阻礙，而細(xì)菌培養(yǎng)則檢驗周期更長，兩者各有優(yōu)劣，可根據(jù)具體情況而定。

B族鏈球菌是廣泛種植于泌尿生殖道，而且與宿主嚴(yán)重感染性疾病密切相關(guān)，研究表明，如果在宮頸中發(fā)現(xiàn)大量B族鏈球菌，可誘發(fā)胎膜早破、早產(chǎn)、敗血癥等妊娠并發(fā)癥，感染是胎膜早破的主要危險因素，B族鏈球菌對絨毛膜的穿透力和吸附力最強，王兆莉等[10]研究表明，B族鏈球菌陽性孕婦產(chǎn)婦胎膜早破發(fā)生率32.00%（8/25）明顯高于B族鏈球菌陰性患者19.27%（53/275）。既往研究表明，B族鏈球菌感染是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要原因之一[11]，孕婦發(fā)生B族鏈球菌感染后，將釋放前列腺素、磷酯酶A、腫瘤壞死因子（TNF）以及白細(xì)胞介素IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等，從而刺激子宮收縮導(dǎo)致早產(chǎn)。本文研究中，GBS陽性孕產(chǎn)婦宮內(nèi)感染、胎膜早破、早產(chǎn)、產(chǎn)后出血均明顯高于GBS陰性孕產(chǎn)婦，提示GBS感染可能與孕婦妊娠結(jié)局有一定的相關(guān)性。

近20年來，B族鏈球菌已成為世界各國新生兒感染性疾病的主要病原菌，B族鏈球菌引起新生兒最常見的病變?yōu)樾律鷥耗摱狙Y，早發(fā)性B族鏈球菌感染極易誘發(fā)新生兒敗血癥、肺炎、腦膜炎，晚發(fā)性感染一般于產(chǎn)后一周甚至10d后開始發(fā)病[12-14]，有學(xué)者[15-16]通過對234例死亡新生兒肺組織B族鏈球菌檢測，報道B族鏈球菌陽性檢出率65%，認(rèn)為B族鏈球菌是導(dǎo)致新生兒肺炎死亡的主要至致病菌。本文研究中，實時PCR檢出29例GBS陽性孕產(chǎn)婦所分娩新生兒中，發(fā)生新生兒肺炎、新生兒敗血癥、新生兒窘迫比例明顯高于CBS陰性孕產(chǎn)婦所分娩新生兒。從這一點來看，重視產(chǎn)前篩查結(jié)果，能夠有效的避免新生兒疾病的發(fā)生，或做好預(yù)防措施，提前治療，改善新生兒預(yù)后。但總體來說，國內(nèi)產(chǎn)前篩查的推廣尚有欠缺，普及程度較低，這也是導(dǎo)致新生兒疾病發(fā)生率高的主要因素。因此建議相關(guān)部門加強該方面的宣教，在社區(qū)等地方做好推廣，提高產(chǎn)前篩查率，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

綜上所述，實時PCR檢測方法檢測B族鏈球菌具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的特點，可能成為B族鏈球菌檢測的常規(guī)方法；B族鏈球菌陽性可明顯增加孕產(chǎn)婦宮內(nèi)感染、胎膜早破、早產(chǎn)、產(chǎn)后出血發(fā)生率，也導(dǎo)致新生兒肺炎、新生兒敗血癥、新生兒窘迫發(fā)生率的增加，應(yīng)引起足夠的重視。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 蔡曉沂，鐘鎬鎬，王秀艷，等.快速、準(zhǔn)確的B族鏈球菌檢測-即時熒光探針核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（13）：2533-2535，2546.

[2] Sweet RL， Gibbs RS. Infectious diseases of the female genital tract[M]. 15th. Wolters Kluwer： Lippincott Williams & Wilkins， 2009：1-9.

[3] Van Dyke MK， Phares CR， Lynfied R， et al. Evaluation funiversal antenatal screening for group B streptococcus[J]. N Engl J Med， 2009，360（4）：2626-2636.

[4] 時春艷，曲首輝，楊磊，等.妊娠晚期孕婦B族鏈球菌帶菌狀況的檢測及帶菌對妊娠結(jié)局的影響[J].中華發(fā)產(chǎn)科雜志，2010，45（1）：12-16.

[5] 蔡曉沂，鐘鎬鎬，王秀艷，等.快速、準(zhǔn)確的B族鏈球菌檢測-即時熒光探針核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（13）：2533-2535，2546.

[6] Centers for Disease Control and Prevention. Prevention of perinatal group B strepococal disease Revised guidelines from CDC [J]. MMWR Recomm Rep， 2002，51（12）：1-22.

[7] 范愛萍，薛鳳霞.需氧菌性陰道炎及其混合感染的臨床特征分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2010，45 （12）：904-908.

[8] Mark P. Prevention of early-onset group B streptococcal disease in newborns[J]. Obstet Gynecol， 2003，102（2）：414-415.

[9] 黃永建，陳波，張勇，等. 孕晚期婦女B族鏈球菌PCR檢測結(jié)果分析[J].江西醫(yī)藥，2013，48（7）：581-584.

[10] 王兆莉，盧德梅，顏勝.孕婦分娩期B族溶血性鏈球菌帶菌與母嬰感染的關(guān)系[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，30（24）：3078-3079.

[11] Chaisilwattnan P， Monif GR. In vitro ability of the group B strepococi to inhibit gram-positive and gram-variable constituents of the bacterial flora of the female genital tract[J]. Infect Dis Obstet Gynecol，1995，79（3）：91-97.

[12] 左緒磊.婦產(chǎn)科感染[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：255-258.

[13] 時春艷，曲首輝，楊慕，等.妊娠晚期孕婦B族鏈球菌帶菌狀況的檢測及帶菌對妊娠結(jié)局的影響[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2010，45（1）：12-16.

[14] Verani JR，McGee L，Schrag SJ，et al .Prevention of perinatal group B streptococcal disease-revise guidelines from CDC，2010[J].MMWR Recomm Rep，2010，59（RR. 10）：31-36.

[15] 江敏，汪偉山.孕婦B族溶血性鏈球菌帶菌狀況與母嬰預(yù)后的研究[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2012，10（4）：506-508.

[16] 彭鳳梅，何春梅，古素芬.孕婦生殖道B族鏈球菌陽性與胎膜早破發(fā)生的關(guān)系[J].現(xiàn)代診斷與治療，2015，26（2）：277-278.

Application on nucleic acid detection of group B streptococcus in prenatal screening

HUANG Manhui1ZHANG Longhui1LI Zhenyu2
1.Department of Gynecology and Obstetrics, Qingxi Hospital of Dongguan City, Guangdong, Dongguan 523660, China; 2.Department of Laboratory, Qingxi Hospital of Dongguan City, Guangdong, Dongguan 523660, China

[Abstract]Objective To study the application value on the nucleic acid detection of group B streptococcus in prenatal screening. Methods 325 pregnant women with single pregnancy intrauterine pregnancy and surviving fetus, who were carried on routine antenatal examination in obstetrical outpationt department of our hospital from July 2012 to June 2014, were selected as the research objects. To respectively carry on the bacterial culture and real-time PCR detection on the vaginal secretion and perianal secretion at 35-37 gestational weeks, to observe the detection effect between the two detection methods, to compare the effect of group B positive and negative streptococcus on the pregnancy outcome of pregnant women and neonatal outcome. Results Of the 325 pregnant women, the positive detection of bacterial culture in group B streptococcus were 13 cases（4%）, and the positive detection of realtime PCR detection were 29 cases（8.92%）, with the specificity of 94.9%, the sensitivity of 100.0%, the positive predictive value of 44.8%, and the negative predictive value of 100.0%. The intrauterine infection, the premature rupture of membranes, the premature delivery, and the postpartum hemorrhage in pregnant women with positive GBS(13.79%, 34.48%, 10.34%, 10.34%) were obviously higher than which in pregnant women with negative GBS (P＜0.05). Conclusion Group B streptococcus carried in late pregnancy have obviously increased the incidence of the intrauterine infection, premature rupture of membranes, premature delivery, postpartum hemorrhage, neonatal pneumonia, neonatal septicemia, and neonatal strccs in pregnant women. The application of nucleic acid detection of group B streptococcus in prenatal screening has important significance.

[Key words]Group B streptococcus; Real-time PCR detection; Pregnancy outcome; Neonatal outcome

[中圖分類號]R714.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B

[文章編號]2095-0616（2015）24- 81-04

[基金項目]廣東省東莞市科技計劃醫(yī)療衛(wèi)生類科研一般項目（201210515000538）。

收稿日期：（2015-10-26）