實(shí)用生物信息技術(shù)課程教學(xué)實(shí)例

羅靜初

（北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京大學(xué)蛋白質(zhì)與植物基因研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京大學(xué)生物信息中心，北京 100871）

自2000年起，本人在北京大學(xué)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院開(kāi)設(shè)“實(shí)用生物信息技術(shù)”課程［1]。本課程以從事分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的碩士或博士研究生為教學(xué)對(duì)象，重點(diǎn)介紹最基本、最常用的生物信息技術(shù)和方法，主要包括：（1）蛋白質(zhì)和核酸序列相似性比對(duì)；（2）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)RefSeq高級(jí)檢索；（3）NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索工具Blast的應(yīng)用；（4）利用MEGA軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)；（5）利用Swiss-PdbViewer軟件顯示、比較和分析蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)。

本文以人、小鼠、大鼠、斑頭雁、灰雁幾個(gè)不同物種的血紅蛋白序列和結(jié)構(gòu)為例，介紹這些常用生物信息技術(shù)和方法的具體應(yīng)用。學(xué)生通過(guò)這些實(shí)例，能夠初步掌握這些方法的具體應(yīng)用，并能舉一反三，將這些方法用于自己的課題研究，學(xué)會(huì)如何利用豐富的網(wǎng)絡(luò)生物信息資源和分析工具解決自己正在進(jìn)行或即將開(kāi)始的研究課題中的實(shí)際問(wèn)題。

1 序列比對(duì)

1.1 研究背景

血紅蛋白是人體血液中重要蛋白質(zhì)分子，其主要生物學(xué)功能為運(yùn)送氧氣。血紅蛋白分子為異源四聚體，可結(jié)合4個(gè)鐵卟啉色素分子。成人血紅蛋白分子由兩個(gè)α-亞基和兩個(gè)β-亞基組成。人類(lèi)基因組中編碼α-亞基的血紅蛋白基因有兩個(gè)，位于16號(hào)染色體短臂的α-珠蛋白基因簇中，其編碼區(qū)核苷酸序列相同，所編碼的蛋白質(zhì)序列自然也相同，各含142個(gè)氨基酸殘基。與人一樣，小鼠和大鼠的血紅蛋白也是四聚體，α-亞基也由142個(gè)氨基酸組成。小鼠和大鼠同屬嚙齒類(lèi)動(dòng)物，其共同祖先距今約2 500萬(wàn)年。而人屬于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，與嚙齒類(lèi)分歧時(shí)間約為9 500萬(wàn)年。對(duì)這3個(gè)物種α-血紅蛋白氨基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，可探索血紅蛋白分子及其編碼基因演化的特點(diǎn)。

1.2 比對(duì)方法和結(jié)果

從國(guó)際蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt中分別提取人和小鼠α-血紅蛋白的FastA格式序列，其序列條目名稱(chēng)分別為HBA_HUMAN（人）、HBA_MOUSE（小鼠）。序列比對(duì)的軟件很多，北京大學(xué)生物信息中心開(kāi)發(fā)的綜合序列分析平臺(tái)WebLab（http：//weblab.cbi.pku.edu.cn/）包括200多個(gè)程序［2]。利用WebLab中基于Needleman-Wunsch全局序列比對(duì)算法的程序Needle，采用默認(rèn)蛋白質(zhì)計(jì)分矩陣BLOSUM62和默認(rèn)空位罰分值（起始空位罰分10.0，延伸空位罰分0.5），比對(duì)結(jié)果如圖1所示。

圖1 人和小鼠血紅蛋白α-亞基氨基酸序列比對(duì)輸出結(jié)果

圖1中上方為統(tǒng)計(jì)值，包括序列長(zhǎng)度（LENGTH）、比對(duì)分值（SCORE）、相同位點(diǎn)（IDENTITY）、相似位點(diǎn)（SIMILARITY）和空位數(shù)（GAPS）。下方為兩條序列的具體比對(duì)結(jié)果，“｜”表示相同位點(diǎn)、“：”表示相似位點(diǎn)，“.”表示不同位點(diǎn)。所謂相似位點(diǎn)，是指該位點(diǎn)的兩個(gè)氨基酸理化性質(zhì)較接近，如蘇氨酸“T”和絲氨酸“S”、纈氨酸“V”和異亮氨酸“I”等。

按上述方法，分別對(duì)人/小鼠、人/大鼠、小鼠/大鼠3個(gè)物種α-血紅蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果如表1所示。

表1 人、小鼠、大鼠血紅蛋白α-亞基氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

從NCBI參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)中提取這3個(gè)物種α-血紅蛋白基因編碼區(qū)序列，用WebLab中的Needle程序進(jìn)行序列比對(duì)，注意選擇核苷酸替換矩陣EDNAFULL，將起始空位罰分改為20.0，延伸空位罰分改為2.0，比對(duì)結(jié)果如表2所示。

1.3 結(jié)果分析

表1為3個(gè)物種血紅蛋白α-亞基氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。出乎意料的是，人和小鼠α-血紅蛋白共有122個(gè)相同位點(diǎn)，占全長(zhǎng)142個(gè)位點(diǎn)的85.9%；而小鼠與大鼠之間的相同位點(diǎn)數(shù)為120個(gè)，占全長(zhǎng)84.5%。換句話說(shuō)，同為嚙齒類(lèi)的小鼠和大鼠，血紅蛋白序列相似性低于嚙齒類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)。之所以出現(xiàn)這一結(jié)果，原因有許多，其中最主要的是密碼子簡(jiǎn)并性，即同一氨基酸在不同物種或不同基因中可能由不同密碼子編碼，蛋白質(zhì)序列相似性高低可能與其編碼核苷酸的相似性高低并不一致。這3個(gè)物種血紅蛋白編碼基因的編碼區(qū)核苷酸序列比對(duì)結(jié)果（表2）顯示，小鼠和大鼠之間的序列相似性為89.3%，高于小鼠和人之間的序列相似性81.6%。

2 數(shù)據(jù)庫(kù)高級(jí)檢索

2.1 研究背景

研究表明，有些基因在一個(gè)物種中只有一個(gè)拷貝，稱(chēng)單拷貝基因，而真核生物基因組中大部分基因按基因家族形式存在，有多個(gè)拷貝，它們或者分布在同一染色體上相鄰區(qū)域，或者分散在整個(gè)基因組不同染色體上?；蚣易宓漠a(chǎn)生包括全基因組水平重復(fù)和染色體片段重復(fù)等多種機(jī)制，是生物演化重要途徑。同一家族的基因往往具有相似生物學(xué)功能，通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，在不同組織、不同環(huán)境或不同發(fā)育階段表達(dá)。例如，無(wú)脊椎動(dòng)物的血紅蛋白由一個(gè)基因編碼，而脊椎動(dòng)物的血紅蛋白則由多個(gè)基因編碼。以人血紅蛋白基因家族為例，分為α-珠蛋白（α-globin）和β-珠蛋白（β-globin）兩個(gè)基因簇，如圖2所示。圖2上方為α-珠蛋白基因簇，位于16號(hào)染色體短臂正鏈150-180 kb區(qū)段，全長(zhǎng)約30 kb，按5'-3'順序依次為ζ、μ、α2、α1和θ-珠蛋白基因。下方為β-珠蛋白基因簇，位于11號(hào)染色體短臂互補(bǔ)鏈5.22-5.27 Mb區(qū)段，全長(zhǎng)約50 kb，依次為ε、γ2、γ1、δ和β-珠蛋白基因。此外，α-珠蛋白基因簇上有兩個(gè)假基因Ψζ和Ψα；β-珠蛋白基因簇上有1個(gè)假基因Ψβ。這10個(gè)珠蛋白基因在不同發(fā)育階段表達(dá)，θ、μ、β和δ在成人血紅細(xì)胞中表達(dá)，γ1和γ2在胎兒血紅細(xì)胞中表達(dá)，ζ和ε在胚胎血紅細(xì)胞中表達(dá)，而α1和α2在成人和胎兒血紅細(xì)胞中均表達(dá)。

表2 人、小鼠、大鼠α-珠蛋白編碼區(qū)核苷酸序列比對(duì)結(jié)果

圖2 人α-珠蛋白和β-珠蛋白基因家族染色體定位

2.2 檢索方法

上述α和β-珠蛋白基因編碼的血紅蛋白氨基酸序列，均存放在國(guó)際蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt中。利用該數(shù)據(jù)庫(kù)提供的高級(jí)檢索功能，可以快速有效地檢索到這些蛋白質(zhì)序列條目。具體檢索步驟如下：

（1）點(diǎn)擊UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)主頁(yè)上方檢索框右側(cè)Advanced下拉式菜單，打開(kāi)彈出式高級(jí)檢索子窗口（圖3-A）。

（2）點(diǎn)擊高級(jí)檢索窗口最上方下拉式選擇菜單中的All，選擇Protein Name［DE] ，在其右側(cè)的文本輸入框中輸入血紅蛋白的英文Hemoglobin。

（3）點(diǎn)擊第2個(gè)下拉式選擇菜單中的All，選擇基因名Gene Name［GN] ，在其右側(cè)的文本輸入框中輸入血紅蛋白的基因名縮寫(xiě)hb（不分大小寫(xiě)），并在后加通配符星號(hào)，即hb*。

（4）點(diǎn)擊該選擇菜單輸入框右側(cè)增加選擇項(xiàng)符號(hào)“+”，彈出第3個(gè)選擇菜單（圖3-B）。

（5）點(diǎn)擊第3個(gè)選擇菜單中的All，選擇物種名Organism［OS] ，在其右側(cè)輸入Human，系統(tǒng)列出該數(shù)據(jù)庫(kù)中與輸入文本Human相關(guān)的所有物種，選擇Human［9606] 。9606為人在NCBI分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)。

（6）點(diǎn)擊檢索窗口右下側(cè)檢索按鈕（圖標(biāo)為放大鏡），提交檢索策略，頁(yè)面顯示UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的所有人血紅蛋白序列條目。

（7）點(diǎn)擊頁(yè)面左側(cè)Reviewed圖標(biāo)，頁(yè)面顯示檢索結(jié)果（圖3-C）。

圖3 利用UniProt高級(jí)檢索界面檢索人血紅蛋白9個(gè)序列條目

2.3 檢索結(jié)果

檢索結(jié)果中列出已經(jīng)通過(guò)人工審閱的9個(gè)人血紅蛋白序列條目。UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)包括Swiss-Prot和TrEMBL兩個(gè)子庫(kù)，其中Swiss-Prot中的序列條目均已經(jīng)通過(guò)人工審閱，而TrEMBL中的序列條目則是利用計(jì)算機(jī)對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)EMBL中的蛋白質(zhì)編碼序列翻譯得到的，未經(jīng)人工審閱。截止2015年3月，Swiss-Prot子庫(kù)中的數(shù)據(jù)條目總數(shù)為547 599條，而TrEMBL子庫(kù)中的數(shù)據(jù)條目總數(shù)為90 860 905條。顯然，這兩個(gè)子庫(kù)的數(shù)據(jù)量差別極大。點(diǎn)擊UniProt網(wǎng)站主頁(yè)面下方UniProt data欄目下的Statistics圖標(biāo)，可以找到這兩個(gè)子庫(kù)的統(tǒng)計(jì)資料文檔UniProt/Swiss-Prot statistics和UniProt/TrEMBL statistics，文檔中有許多圖表，詳細(xì)敘述這兩個(gè)子庫(kù)的基本情況。

3 數(shù)據(jù)庫(kù)序列相似性搜索

3.1 研究背景

利用上述蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)高級(jí)檢索方法，可以快速高效地找到人血紅蛋白基因家族9個(gè)成員所編碼的蛋白質(zhì)序列。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，除了運(yùn)送氧氣的血紅蛋白和儲(chǔ)存氧氣的肌紅蛋白外，人體中還有另外兩種珠蛋白分子，一種為細(xì)胞紅蛋白，或簡(jiǎn)稱(chēng)胞紅蛋白（Cytoglobin），普遍存在于各種組織，可能具有氧儲(chǔ)存、氧感受、一氧化氮運(yùn)輸、抗自由基等多種功能。另一種為神經(jīng)紅蛋白（Neuroglobin），多見(jiàn)于腦組織，因此也稱(chēng)腦紅蛋白。胞紅蛋白基因位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂25區(qū)（17q25），編碼190個(gè)氨基酸殘基；腦紅蛋白基因位于14號(hào)染色體長(zhǎng)臂24區(qū)（14q24），編碼151個(gè)氨基酸殘基。X衍射晶體結(jié)構(gòu)研究證明，這兩種蛋白質(zhì)分子的三維空間結(jié)構(gòu)與血紅蛋白、肌紅蛋白具有相同折疊模式，同屬珠蛋白家族（Globin family）。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩者與血紅蛋白序列相似性均很低。胞紅蛋白與血紅蛋白α-亞基的相同位點(diǎn)共42個(gè)，約占22%；腦胞紅蛋白與血紅蛋白α-亞基的相同位點(diǎn)僅31個(gè)，不到20%。

3.2 搜索方法

利用BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索，可以通過(guò)局部序列比對(duì)方法，從數(shù)據(jù)庫(kù)中找到相似性較高的序列或序列片段。例如，以人血紅蛋白α-亞基HBA_HUMAN為檢測(cè)序列，可以從Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到與其相似性較高的其它物種血紅蛋白α-亞基序列。而對(duì)于腦紅蛋白這樣相似性很低的序列，則需要通過(guò)選擇搜索程序、確定搜索數(shù)據(jù)庫(kù)、限制搜索物種、設(shè)置適當(dāng)?shù)乃阉鲄?shù)，才能搜索到。具體步驟如下：

（1）打開(kāi)NCBI BLAST服務(wù)器主頁(yè)面，在常用BLAST選擇區(qū)（Basic BLAST）中選擇蛋白質(zhì)BLAST（protein blast），將人血紅蛋白α-亞基HBA_HUMAN序列粘貼到檢測(cè)序列輸入框。

（2）在數(shù)據(jù)庫(kù)選擇框（Database）中選擇Swissprot protein sequence（swissprot），在物種選擇框（Organism）中輸入Human。

（3）在程序選擇區(qū)選擇位點(diǎn)特異迭代型BLAST（Position-specific Iterated BLAST），即PSI-BLAST。

（4）打開(kāi)參數(shù)選擇（Algorithm parameters）窗口，將錯(cuò)誤率（Expected threshold）由缺省值10調(diào)為0.001。

（5）點(diǎn)擊運(yùn)行BLAST按鈕遞交作業(yè)，搜索結(jié)果得到11個(gè)珠蛋白分子。

（6）點(diǎn)擊“運(yùn)行第2次PSI-Blast”（Run PSIBlast iteration 2 with max 50）按鈕（Go），新一輪搜索結(jié)果中包括腦紅蛋白（Neuroglobin，Siwss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)Q9NPG2.1）。

3.3 搜索結(jié)果

搜索結(jié)果（圖4）顯示，人12個(gè)珠蛋白均在搜索結(jié)果中，而與珠蛋白無(wú)關(guān)的其它序列則沒(méi)有列在搜索結(jié)果中。也就是說(shuō)，搜索結(jié)果既無(wú)假陽(yáng)性（False positive）結(jié)果，也無(wú)假陰性（False negative）結(jié)果。

上述搜索過(guò)程說(shuō)明，BLAST是一個(gè)功能強(qiáng)大的序列相似性數(shù)據(jù)庫(kù)搜索系統(tǒng)。但要用好BLAST，必須對(duì)其基本算法有所了解，例如位置特異性迭代BLAST的原理、計(jì)分矩陣、錯(cuò)誤率E值的選取等。

圖4 利用BLAST從Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索12個(gè)珠蛋白

4 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建

4.1 研究背景

研究表明，人、小鼠和大鼠3種哺乳動(dòng)物中，均有血紅蛋白、肌紅蛋白、胞紅蛋白和腦紅蛋白4類(lèi)珠蛋白基因家族成員，其中肌紅蛋白、胞紅蛋白和腦紅蛋白在這3個(gè)物種基因組中均為單拷貝基因，而血紅蛋白α和β-兩個(gè)亞家族均包含多個(gè)拷貝，在3個(gè)物種基因組中的數(shù)目、分布也不相同。美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)從事血紅蛋白研究多年的哈迪森教授2012年發(fā)表的“血紅蛋白及其基因的演化”綜述中，對(duì)人和其它脊椎動(dòng)物的血紅蛋白起源、演化、表達(dá)和功能做了詳細(xì)介紹［3]。圖5 是根據(jù)該論文中的插圖改編的人、小鼠、大鼠3個(gè)物種基因組中α-和β-珠蛋白基因家族成員名稱(chēng)和在染色體上的排列次序。

上述3個(gè)物種中，人類(lèi)基因組的血紅蛋白基因家族研究得比較清楚，而小鼠和大鼠血紅蛋白的基因家族的大部分成員是根據(jù)基因組、轉(zhuǎn)錄組序列預(yù)測(cè)所得，尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。表3列出這3個(gè)物種中已經(jīng)確定的37個(gè)成員。

圖5 人、小鼠、大鼠α-珠蛋白和β-珠蛋白基因家族

需要說(shuō)明的是，小鼠腦紅蛋白基因有兩個(gè)剪接變體，RefSeq參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA序列登錄號(hào)為NM_022414和NM_001294308。NM_022414編碼區(qū)長(zhǎng)度453 bp，編碼151個(gè)氨基酸；NM_001294308編碼區(qū)長(zhǎng)度465 bp，編碼155個(gè)氨基酸。表中只列出其中一個(gè)NM_022414。小鼠β-珠蛋白家族成員MmHbb-b1和MmHbb-b2為單倍體型C57BL/-株系基因組中測(cè)得的序列，RefSeq參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA序列登錄號(hào)為NM_001278161和NM_016956。小鼠基因組計(jì)劃測(cè)序樣本所用的為融合體BALB/c和129Sv株系。小鼠基因組信息系統(tǒng)（MGI）中所列小鼠β-珠蛋白家族成員基因名為MmHbb-bs和MmHbb-bt，RefSeq mRAN登錄號(hào)為NM_001201391和NM_008220，表中未予列出。

此外，大鼠基因組中α-珠蛋白家族共有7個(gè)成員［3]，位于10號(hào)染色體15.468-15.508 Mb區(qū)段，長(zhǎng)度約為40 kb；表8中只收錄已有轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的3個(gè)，即RnHbz（NM_013096）、RnHba1（NM_013096）和RnHba2（NM_001007722）。另4個(gè)尚無(wú)確切證據(jù)，也無(wú)確定的基因名，未在表中列出。這4個(gè)基因中，一個(gè)為α-珠蛋白，RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA序列登錄號(hào)為 NM_001013853，大鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)RGD中暫定基因名為L(zhǎng)OC287167；其它3個(gè)為θ-珠蛋白，尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。大鼠基因組中，β-珠蛋白共有9個(gè)成員，位于1號(hào)染色體175.095-175.170 Mb區(qū)段，約75 kb（圖6），其中1個(gè)為假基因，4個(gè)為串聯(lián)重復(fù)排列的α-珠蛋白，推測(cè)由近期發(fā)生的基因倍增機(jī)制產(chǎn)生。

4.2 建樹(shù)方法

利用上述3個(gè)物種基因組中的血紅蛋白及同一家族的肌紅蛋白、胞紅蛋白和腦紅蛋白序列信息，可以構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)是以樹(shù)狀圖表示不同物種之間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的常用方法。達(dá)爾文“物種起源”一書(shū)中唯一的一幅插圖，就是用樹(shù)的形式表示物種多樣性及其起源和演化。因此，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，有時(shí)也稱(chēng)“進(jìn)化樹(shù)”或“演化樹(shù)”。其實(shí)，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)不僅可以用來(lái)表示不同物種之間的親緣關(guān)系和演化途徑，也可以用來(lái)表示同一物種內(nèi)部某個(gè)基因家族的不同成員之間的關(guān)系及演化。

利用MEGA軟件包［4]，可以構(gòu)建人的珠蛋白基因家族12個(gè)成員系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，所用序列為蛋白質(zhì)序列，用全局比對(duì)程序ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，用GONNET蛋白質(zhì)計(jì)分矩陣，空位罰分和其它參數(shù)均采用默認(rèn)值。用鄰接法（Neighbor-Joining）建樹(shù)，采用差異位點(diǎn)比例（p-distance）為距離模型，選擇自舉法（Bootstrap）100次作為穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

利用MEGA軟件包中的鄰接法（Neighbor-Joining）方法構(gòu)建人、小鼠、大鼠3個(gè)物種珠蛋白基因家族37個(gè)成員系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖8），所用序列為編碼區(qū)核苷酸質(zhì)序列。序列比對(duì)采用ClustalW Codon，即基于密碼子的序列比對(duì)，比對(duì)過(guò)程中密碼子3個(gè)核苷酸不打斷，雙序列和多序列比對(duì)的起始空位罰分均調(diào)為20，延伸空位罰分均調(diào)為2.0，以減少不必要的空位插入。建樹(shù)過(guò)程中采用差異位點(diǎn)比例（p-distance）為序列差異模型，用轉(zhuǎn)換加顛換（transition + transversion）為核苷酸替換模型，選擇自舉法（Bootstrap）100次作為穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

4.3 結(jié)果分析

圖7所示的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)為基因樹(shù)。結(jié)果表明，人的12個(gè)珠蛋白基因可以分為5個(gè)分支，其中α-珠蛋白亞家族包括4個(gè)成員，β-珠蛋白亞家族包括5個(gè)成員，而肌紅蛋白、胞紅蛋白和腦紅蛋白各有1個(gè)成員。α-珠蛋白和β-珠蛋白有共同祖先，而肌紅蛋白和胞紅蛋白有共同祖先。α-珠蛋白亞家族4個(gè)成員中，α-珠蛋白和θ-珠蛋白之間的距離較近，而β-珠蛋白亞家族5個(gè)亞家族中，γ1-珠蛋白和γ2-珠蛋白的距離最近，其次為α-珠蛋白和δ-珠蛋白。

表3 人、小鼠、大鼠3個(gè)物種珠蛋白家族基因信息

圖8所示的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)包括3個(gè)物種，每個(gè)物種均有多個(gè)基因，共37個(gè)基因。結(jié)果表明，37個(gè)基因總體可以分為5個(gè)分支，即α-珠蛋白、β-珠蛋白、肌紅蛋白、胞紅蛋白和腦紅蛋白。3個(gè)物種的肌紅蛋白、胞紅蛋白和腦紅蛋白各聚為一支；3個(gè)物種所有α-珠蛋白聚在一起，所有β-珠蛋白聚在一起。這一結(jié)果說(shuō)明，這5類(lèi)基因在3個(gè)物種形成以前就已經(jīng)出現(xiàn)，即“先有基因、后有物種”。α-珠蛋白分為3支，第一支為ζ-珠蛋白，3個(gè)物種各有一個(gè)成員，即人的HsHBZ、小鼠的MmHba-x和大鼠的RnHbz；第二支又分兩支，一支為α-珠蛋白，另一支為θ-珠蛋白。3個(gè)物種的α-珠蛋白各有兩個(gè)成員，如人的HsHBA1和HsHBA2，θ-珠蛋白各有1個(gè)成員。可以推斷，α-珠蛋白的兩個(gè)成員是在靈長(zhǎng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)分化以后通過(guò)基因倍增機(jī)制產(chǎn)生的，即“先有物種、后有基因”。β-珠蛋白基因簇在這3個(gè)物種的起源和演化留給讀者自行分析。

圖6 大鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)RGD中α-珠蛋白（A）和β-珠蛋白（B）基因家族信息

圖7 人珠蛋白家族12個(gè)蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較和分析

5.1 研究背景

基于蛋白質(zhì)和核酸序列，我們已對(duì)人、小鼠和大鼠3個(gè)物種的血紅蛋白進(jìn)行了比較分析。下面，我們以斑頭雁和灰雁為例，利用生物信息方法和結(jié)構(gòu)分析軟件，對(duì)血紅蛋白的序列、結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系進(jìn)行分析。

斑頭雁在分類(lèi)學(xué)上為鳥(niǎo)綱（Aves）、雁形目（Anseriformes）、鴨科（Anatidae）、雁屬（Anser），拉丁文學(xué)名分別為Anser indicus，英文名為Barheaded goose。斑頭雁為典型的候鳥(niǎo)，夏季生活在我國(guó)西部青海湖，每年9月初往南遷徙，經(jīng)過(guò)近兩個(gè)月的長(zhǎng)途跋涉，飛躍喜馬拉雅山，大約10月中下旬飛抵印度平原過(guò)冬。每年春季開(kāi)始又往北遷徙，飛回青海湖，周而復(fù)始，年年如此?；已悖ㄓ⑽拿麨镚rayleg goose，美國(guó)英語(yǔ)多用Greyleg goose）的拉丁文學(xué)名分別為Anser anser，與斑頭雁同為鴨科、雁屬，主要生活在印度平原［5]。我們知道，地球表面氧分壓隨海拔增高而降低，斑頭雁飛躍的喜馬拉雅山巔，氧分壓不到平原地區(qū)的一半。斑頭雁這種高空長(zhǎng)度遷徙的能力，是否與其血紅蛋白分子的特征有關(guān)，是一個(gè)值得研究的有趣問(wèn)題。

圖8 人、小鼠、大鼠3個(gè)物種珠蛋白家族系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

1983年，英國(guó)劍橋分子醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室已故著名血紅蛋白研究專(zhuān)家佩魯茨（Max Perutz）在分子生物學(xué)和演化雜志（Molecular Biology and Evolution）創(chuàng)刊號(hào)上發(fā)表的題為“從蛋白質(zhì)分子看物種的適應(yīng)性”綜述中指出，斑頭雁和灰雁的血紅蛋白氨基酸序列僅有4個(gè)位點(diǎn)差異，其中α-亞基的119位比較特殊［6]。斑頭雁α-亞基該位點(diǎn)位序氨酸（A119Ala），而灰雁該位點(diǎn)為脯氨酸（A119Pro）。蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)分析表明，該位點(diǎn)與β-亞基第55位的亮氨酸（B55Leu）空間距離較近。我們知道，成熟的血紅蛋白為四聚體，由兩個(gè)α-亞基和兩個(gè)β-亞基組成，各含一個(gè)血色素卟啉環(huán)，環(huán)中央的五價(jià)鐵離子用于結(jié)合氧氣。結(jié)合氧氣和釋放氧氣過(guò)程中，血紅蛋白四個(gè)亞基構(gòu)象發(fā)生變化，并通過(guò)協(xié)同作用，提高結(jié)合氧氣的效率。佩魯茨指出，斑頭雁α-亞基119位的丙氨酸側(cè)鏈僅有一個(gè)甲基，與β-亞基55位亮氨酸側(cè)鏈距離較遠(yuǎn)，有利于構(gòu)象變化；而灰雁該位點(diǎn)側(cè)鏈脯氨酸有3個(gè)甲基，與β-亞基55位亮氨酸側(cè)鏈距離較近，不利于構(gòu)象變化。這兩種鳥(niǎo)類(lèi)血紅蛋白序列結(jié)構(gòu)的差異，可能與其結(jié)合氧氣的能力有關(guān)。20世紀(jì)90年代，北京大學(xué)生物系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究組，用蛋白質(zhì)分子晶體X-衍射的方法，分別測(cè)定了斑頭雁和灰雁血紅蛋白的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了比較分析，證實(shí)了當(dāng)年佩魯茨的推測(cè)［7]。

5.2 研究方法

利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示和模擬軟件Swiss-PdbViewer［8]，我們可以對(duì)已經(jīng)測(cè)定的斑頭雁和灰雁氧合血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。具體操作步驟大體如下：

從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB（http：//www.rcsb.org/）下載斑頭雁和灰雁氧合血紅蛋白三維空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件1A4F.pdb和1FAW.pdb。

（1）在Swiss-PdbViewer中打開(kāi)灰雁血紅蛋白數(shù)據(jù)文件1FAW.pdb，選擇其中A和B兩條鏈（即α和β-兩個(gè)亞基），保存為新文件1FAWab.pdb。

（2）打開(kāi)新保存的文件1FAWab.pdb，選擇只顯示主鏈模式；打開(kāi)斑頭雁血紅蛋白數(shù)據(jù)文件1A4F.pdb，也選擇只顯示主鏈模式。

（3）利用該軟件包中的結(jié)構(gòu)疊合工具M(jìn)agic Fit，可以發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)總體十分相似。

（4）在控制面板中找到斑頭雁α-亞基119位的丙氨酸和β-亞基55位亮氨酸，顯示它們的側(cè)鏈原子，測(cè)量它們之間的距離。

（5）在控制面板中找到灰雁α-亞基119位的脯氨酸和β-亞基55位亮氨酸，顯示它們的側(cè)鏈原子，測(cè)量它們之間的距離。

5.3 結(jié)果分析

上述斑頭雁和灰雁血紅蛋白三維結(jié)構(gòu)的比較分析表明，斑頭雁氧合血紅蛋白1A4F α-亞基119位丙氨酸側(cè)鏈的β碳原子（CB）與β-亞基55位亮氨酸側(cè)鏈末端的兩個(gè)δ碳原子（CD1和CD2）距離均在4 ?以上，最近距離為4.56 ?；而灰雁該位點(diǎn)側(cè)鏈脯氨酸γ碳原子與β-亞基55位亮氨酸側(cè)鏈末端的一個(gè)碳原子距離為3.79 ?。這一差別很可能影響血紅蛋在結(jié)合和釋放氧氣過(guò)程中構(gòu)象發(fā)生變化，從而影響其結(jié)合氧氣能力，造成這兩種鳥(niǎo)類(lèi)不同的生活習(xí)性。

圖9 斑頭雁（A）和灰雁（B）血紅蛋白結(jié)構(gòu)比較

圖9為利用PyMol分子結(jié)構(gòu)顯示軟件繪制的分析結(jié)果。與Swiss-Pdbviewer相比，其圖形顯示和輸出功能更強(qiáng)。

6 結(jié)語(yǔ)

以上我們以血紅蛋白序列和結(jié)構(gòu)為例，介紹“實(shí)用生物信息技術(shù)”課程教學(xué)種用到的幾種生物信息方法。希望選修本課程的學(xué)生對(duì)本課程的教學(xué)有所了解，也希望對(duì)自學(xué)生物信息技術(shù)及其應(yīng)用的讀者有所啟發(fā)。關(guān)于本課程的詳細(xì)介紹和具體內(nèi)容，讀者可瀏覽本課程專(zhuān)用教學(xué)網(wǎng)站（http：//abc.cbi.pku.edu.cn/），參閱筆者生物信息學(xué)簡(jiǎn)報(bào)（Briefings in Bioinformatics）相關(guān)文章［1]。

［1] Luo J. Teaching the ABCs of bioinformatics：a brief introduction to the Applied Bioinformatics Course［J] . Brief Bioinform, 2014,15：1004-1013.

［2] Liu X, Wu J, Wang J, et al. WebLab：a data-centric, knowledgesharing bioinformatic platform［J] . Nucleic Acids Res, 2009, 37：W33-39.

［3] Hardison RC. Evolution of hemoglobin and its genes［J] . Cold Spring Harb Perspect Med, 2012, 2：a011627.

［4] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6：Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6. 0［J] . Mol Biol Evol,2013, 30：2725-2729.

［5] Jessen TH, Weber RE, Fermi G, et al. Adaptation of bird hemoglobins to high altitudes：demonstration of molecular mechanism by protein engineering［J] . Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88：6519-6522.

［6] Perutz MF. Species adaptation in a protein molecule［J] . Mol Biol Evol, 1983, 1：1-28.

［7] Zhang J, Hua Z, Tame JR, et al. The crystal structure of a high oxygen affinity species of haemoglobin［J] . J Mol Biol, 1996,255：484-493.

［8] Guex N, Peitsch MC, Schwede T. Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer：a historical perspective［J] . Electrophoresis, 2009, 30：S162-173.