玉米孤雌生殖單倍體高效誘導研究

劉曉鑫，慈佳賓，崔學宇，張 野，趙 超，楊偉光

(吉林農業(yè)大學 農學院，吉林 長春 130118)

玉米孤雌生殖單倍體高效誘導研究

劉曉鑫，慈佳賓，崔學宇，張 野，趙 超，楊偉光

(吉林農業(yè)大學 農學院，吉林 長春 130118)

【目的】 分析不同因素處理下玉米單倍體誘導率的變化，以提出高效誘導玉米單倍體的技術措施。【方法】 研究不同母本基因型、世代選擇、生態(tài)環(huán)境、授粉時期、果穗部位等5個處理因素對玉米單倍體誘導率的影響?！窘Y果】 母本基因型間單倍體的誘導效率差異顯著，但不同雜交模式與誘導率之間沒有必然的聯(lián)系；5大種質類群S1世代為單倍體最佳誘導世代；與長春吉林相比，海南三亞的生態(tài)環(huán)境更有利于提高單倍體的誘導率；早期授粉的單倍體誘導率高于晚期授粉；果穗底部籽粒的單倍體誘導率低于頂部籽粒?！窘Y論】 選擇高頻的母本材料、適宜的誘導世代、在合適的地點于吐絲早期進行單倍體誘導是單倍體誘導的最佳方案。

玉米；單倍體育種；誘導率

單倍體育種是指利用單倍體誘導系結合標記性狀誘發(fā)，再通過染色體組加倍(包括自然和人工加倍)等手段使植株恢復正常染色體數(shù)的一種育種方法。玉米單倍體育種技術是一種快速獲得玉米自交系的新方法，它的顯著特點是能大大縮短自交系的選育時間。利用常規(guī)育種方法一般要經過6～7代(3～4年)才可得到自交系，而利用單倍體技術只需2代(1年)就可以得到[1]。近年來，玉米單倍體育種技術與常規(guī)育種技術的有機結合，提高了玉米育種的效率，開辟了玉米育種的新途徑[2]。

單倍體植株經染色體加倍后，在一個世代中即可出現(xiàn)純合的二倍體，從中選出的優(yōu)良純合系后代不分離，表現(xiàn)整齊一致，可縮短育種年限[3]。單倍體植株中由隱性基因控制的性狀，雖經過染色體加倍，但由于沒有明顯基因的掩蓋而容易顯現(xiàn)，這對于誘變育種和突變遺傳研究很有好處[4]。鑒于此，國內外各大公司、科研院所和高等院校相繼開展玉單倍體育種，以加速培育優(yōu)良自交系，并應用于玉米育種研究中[5]。但在玉米單倍體育種實踐中，單倍體誘導率低[6]、難以獲得足夠數(shù)量的單倍體，成為亟待解決的問題。

黎亮等[7]研究表明，不同母本基因型間單倍體的誘導效率差異很大；李國良等[8]的研究結果表明，誘導蘭卡斯特類群材料產生單倍體的頻率要顯著高于瑞德、塘四平頭、旅大紅骨類群和地方種質群；R?ber等[9]報道，不同環(huán)境間誘導率差異很大，在比較差的環(huán)境下平均誘導率僅2.0%，而在理想的環(huán)境下誘導率可以高達16.4%；黎亮等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，海南冬季的誘導率顯著高于北京夏季。單倍體的誘導是單倍體育種的前提，但由于誘導系受到上述被誘導母本材料和誘導環(huán)境等因素的影響，使得該技術的“工廠化”應用受到限制。因此如何優(yōu)化誘導技術、提高誘導系的誘導效率、充分發(fā)揮誘導系的誘導效能，一直是人們探索的重要課題。本研究分析和探討了實際玉米育種中不同誘導因素下誘導率的變化特點，進而提出高效誘導單倍體的技術措施，以期為有效利用單倍體誘導系和單倍體誘導技術提高育種效率并選育自有的單倍體誘導系及快速培育玉米自交系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 單倍體誘導的母本基因型效應

根據(jù)東北地區(qū)玉米育種實踐中常用的親本材料和主要的雜種優(yōu)勢模式，于2011年春季選擇10個自交系、10個雜交組合作為母本(即被誘導材料)，種植于吉林農業(yè)大學長春玉米育種基地，每個試驗材料種植1行，行距65 cm，株距25 cm，無區(qū)組重復，試驗材料及編號見表1。父本材料為誘導系JS6-1，是吉林農業(yè)大學作物遺傳育種教研室選育的遺傳標記明顯、花粉量大、持粉時間長、抗病性好的新型誘導系。

表1 玉米單倍體誘導母本基因型效應試驗供試母本材料Table 1 Experimental female maize materials of maize haploid induced female genotype effect test

于母本吐絲3～4 d后進行授粉，每個試驗材料雜交10～20穗，收獲后在果穗上挑選胚芽無色、粒頂紫色、胚呈近三角形的籽粒為準單倍體，所有準單倍體于2012年春種植于吉林農業(yè)大學長春玉米育種基地，進行進一步的種植鑒定，其中單倍體表現(xiàn)為植株矮小、葉片和莖稈綠色、多為不育，而雜交二倍體表現(xiàn)為植株高大、莖稈紫色、花粉可育。根據(jù)田間鑒定結果統(tǒng)計不同基礎材料的單倍體誘導率。

試驗原始數(shù)據(jù)先在Excel 2007軟件中進行處理，再用DPS 7.1軟件進行數(shù)據(jù)分析[10]。群單倍體誘導率的計算采用李國良等[11]的方法。

群單倍體誘導率=本群單倍體粒數(shù)/群總粒數(shù)×100%。

1.2 不同種質世代的選擇效應

母本材料為吉林農業(yè)大學作物遺傳育種教研室經過多輪選擇獲得的不同世代的4大種質類群和溫帶Ⅰ群(表2)，父本材料為JS6-1。2011年春季，將玉米材料種植于吉林農業(yè)大學長春玉米育種基地，每個材料種植2行，行距65 cm，株距25 cm，無區(qū)組重復，同年7月進行雜交授粉，9月收獲，共獲得不同世代5個基礎種質群250個雜交果穗，共收獲 48 642 粒種子，其中準單倍體2 806粒。2012年春，將收獲的不同世代種質類群的準單倍體種子進行田間播種，采用完全隨機試驗設計，單倍體鑒定的方法同1.1。

表2 玉米單倍體誘導不同種質世代試驗供試母本材料Table 2 Experimental female maize materials of maize haploid induced different germplasm generations test

1.3 不同生態(tài)環(huán)境條件的誘導效應

以吉林農業(yè)大學玉米遺傳育種課題組選育的品種JNY103、JNY116和JNY688以及生產上推廣面積較大的先玉335(XY335)和鄭單958(ZD958)共5個雜交種作母本(表3)，以誘導系JS6-2(農大高誘1號改良系)為父本進行試驗。每個雜交組合選擇10個以上果穗用于單倍體誘導率的測定，試驗于2011年在吉林長春和海南三亞進行，長春基地行距65 cm，株距21 cm；三亞基地行距90 cm，株距17 cm。為了進一步研究不同年份長春和三亞兩地間單倍體誘導率的差異，2011，2012和2013年選擇胚部標記表達較好的雜交種鄭單958作母本，JS6-2為父本，進行雜交誘導獲得單倍體籽粒，在長春和三亞分別進行單倍體鑒定，具體鑒定方法同1.1節(jié)。2010年鑒定數(shù)據(jù)來源于吉林農業(yè)大學玉米遺傳育種課題組在長春和三亞兩地的試驗結果。

表3 供試母本玉米材料的血緣及及優(yōu)勢模式Table 3 Consanguinity and heterosis pattern of experimental female maize materials

1.4 不同授粉時期的選擇效應

試驗于2011和2012年夏在吉林農業(yè)大學長春玉米育種基地進行。分別以ZD958、JNY698、農華101(NH101)、JNY107為母本，以誘導系JS6-1為父本，選擇不同的時期進行授粉。根據(jù)母本吐絲后時間(將即將吐絲定義為0 d，剛吐絲時定義為1 d，依次往后記錄吐絲后時間)劃分授粉時期，具體分為以下3個處理：(1)早期授粉，0～吐絲后1 d授粉；(2)中期授粉，吐絲后3～4 d授粉；(3)晚期授粉，吐絲后 6～9 d授粉。收獲后根據(jù)不同的處理，選擇結實性好的果穗混合脫粒以進行單倍體的鑒定，僅第一年雜交后鑒定，具體鑒定方法同1.1。

1.5 果穗不同部位誘導率的差異

試驗于2011年冬天在吉林農業(yè)大學三亞育種基地進行。選擇5個雜交種(ZD958、XY335、利民33(LM33)、JNY698、NH101)為母本(表4)，以誘導系JS6-3(吉高誘3號改良系)作父本，雜交30穗，收獲后選擇結實性好的果穗按底部和頂部(各約占果穗長度的1/2)分開脫粒，根據(jù)籽粒顏色標記進行單倍體的初步鑒定。單倍體的進一步種植鑒定于2012年夏在吉林長春進行，僅第1年雜交后鑒定，具體鑒定方法同1.1節(jié)。

表4 玉米單倍體誘導果穗不同部位試驗供試母本材料Table 4 Experimental female maize materials of maize haploid induced different parts of ear test

2 結果與分析

2.1 不同玉米母本材料對單倍體誘導率的影響

由表5可知，誘導系JS6-1對不同母本材料均具有誘導孤雌生殖單倍體的能力。不同母本材料經誘導后誘導率存在明顯差異，誘導率最高的是L-18(PH6WC×S122)，為10.13%，最低的是L-17(PHGJ4×丹340)，為4.97%，平均誘導率為8.42%。由此可見，單倍體誘導率的高低受母本基因型材料影響很大，但誘導效率的高低與雜種優(yōu)勢模式沒有必然的聯(lián)系，如誘導率最高和最低的2個雜交種均來自于Reid×旅大紅骨的模式。

表5 不同玉米母本材料的單倍體誘導率Table 5 Haploid inducing rates of different female parent materials

2.2 不同玉米種質和世代對單倍體誘導率的影響

由表6可知，在JS6-1誘導下，5個種質類群和5個種質世代均能產生單倍體，不同種質類群和種質世代的群單倍體誘導率差異明顯。不同種質類群、不同種質世代單倍體誘導率的二因素方差分析結果見表7。由表7可知，不同種質類群間P=0.006 4<0.01，達到極顯著水平；不同世代間P=0.018 0<0.05，達到顯著水平。

由表8可知，在不同種質類群單倍體誘導率的多重比較中，5大類群單倍體平均誘導率存在差異，其中Lancaster群、Reid群、塘四平頭群和旅大紅骨群單倍體誘導率分別為4.94%，4.88%，4.16%和4.08%，彼此之間差異不顯著，但均極顯著高于溫帶Ⅰ群(2.12%)。在不同世代單倍體誘導率的多重比較中，同一類群不同世代間誘導率存在差異，S4和S5世代群單倍體平均誘導率分別為5.28%和5.00%，差異不顯著；S3、S2和S1世代群單倍體誘導率分別為3.40%，3.32%和3.18%，差異不顯著，但均顯著低于S4和S5世代。誘導系JS6-1對S1代平均株單倍體誘導粒數(shù)是12.36粒，與S2和S3世代差異不顯著，但顯著高于S4和S5代，S2、S3、S4和S5世代間平均株單倍體粒數(shù)差異均不顯著。綜上，5大種質類群S1世代為單倍體最佳誘導世代。

表6 不同玉米種質類群和世代的單倍體誘導率Table 6 Haploid inducing rates of different maize germplasm and generations

表7 不同玉米種質類群和世代單倍體誘導率的方差分析Talbe 7 Variance analysis on haploid induction rates of different maize germplasm and generations

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:*indicates significant differences (P<0.05),** indicates extremely significant difference (P<0.01).

表8 不同玉米種質群和世代間單倍體誘導率及每株單倍體粒數(shù)Table 8 Haploid inducing rates of the different maize germplasm and generations and haploids per plant

注： 同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表現(xiàn)差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05),while different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

2.3 不同生態(tài)環(huán)境對玉米單倍體誘導率的影響

由表9可以看出，三亞冬季的單倍體誘導率高于長春夏季，其中先玉335、鄭單958、JNY116在三亞的單倍體誘導率顯著高于長春(P<0.05)，JNY688和JNY103在兩個地點間的誘導率差異不顯著。從表10可以看出，三亞的單倍體誘導率極顯著(P<0.01)高于長春，其中三亞冬季的平均誘導率為3.39%，而長春夏季的誘導率僅為1.92%。

2.4 不同授粉時期對玉米單倍體誘導率的影響

由表11可知，從總體上來看同一母本吐絲后延遲授粉會降低單倍體的誘導率，但也有例外，如2011年以JNY107為母本，2012年以鄭單958、JNY698為母本于晚期授粉(吐絲后6～9 d授粉)時的單倍體誘導率高于中期授粉(吐絲后3～4 d授粉)的誘導率。此外，早期授粉(0～吐絲后1 d授粉)的單倍體平均誘導率最高(2.06%)；其次是中期授粉(1.75%)；晚期期授粉的誘導率最低(1.45%)。方差分析結果表明，不同雜交種間單倍體的誘導率差異達到顯著水平，而不同授粉時間的單倍體誘導率未達顯著差異。盡管如此，由于授粉時間越晚，果穗結實性越差，因此早期授粉獲得單倍體的數(shù)量明顯高于晚期授粉。

表9 不同玉米品種在長春和三亞兩地的單倍體誘導率比較Table 9 Comparison of haploid inducing rates of different hybrids between Changchun and Sanya

注：同行數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表現(xiàn)差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each row indicate significant difference (P<0.05),while different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

表10 不同年份鄭單958與JS6-2雜交玉米在三亞和長春兩地的單倍體誘導率比較Table 10 Comparison of haploid inducing rates of Zhengdan 958 crossing with JS6-2 in different years between Sanya and Changchun

注： 同行數(shù)據(jù)后標不同大寫字母表現(xiàn)差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different uppercase letters in each row indicate extremely significant difference (P<0.01).

表11 玉米母本吐絲后不同時間和JS6-1雜交后的單倍體誘導率比較Table 11 Comparison of haploid inducing rates of male parents crossing with JS6-1 at different pollination stages

2.5 玉米果穗不同部位單倍體誘導率的差異性

從表12可以看出，除了NH101之外，其余4個雜交果穗頂部的單倍體誘導率均高于底部；頂部籽粒的單倍體頻率為4.36%，而底部籽粒的單倍體頻率為3.52%。t測驗表明，XY335、JNY698 和NH101頂部和底部籽粒單倍體誘導率存在極顯著差異(P<0.01)，鄭單958和利民33頂部和底部的單倍體頻率差異不顯著。

表12 玉米果穗頂部和底部的單倍體誘導率比較Table 12 Comparison of haploid inducing rates between top and bottom parts of corn ear

注：同一母本果穗不同部位相比單倍體誘導率數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different parts of same parent (P<0.05),while different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

3.1 誘導系與母本基因型的互作

目前關于單倍體誘導率影響因素以及提高單倍體誘導效率的措施研究鮮見報道。本研究表明，不同母本基因型間單倍體的誘導效率差異顯著，這與R?ber等[9]、劉志增等[12]的研究結果一致。Chase[13]認為，這種影響是由于母本基因型所產生的雌配子中有害基因的頻率不同所致。本研究結果表明，Lancaster群、Reid群、塘四平頭群和旅大紅骨群分別為4.94%，4.88%，4.16%和4.08%，彼此之間差異不顯著，但上述4群單倍體誘導率均極顯著高于溫帶Ⅰ群(2.12%)。本研究選用的20種基礎材料雖涵蓋了東北地區(qū)常用自交系及雜交模式，但尚未發(fā)現(xiàn)不同雜交模式與誘導率之間存在明顯的相關性，因此不同種質背景與單倍體誘導率之間的關系仍需要進一步研究。

3.2 誘導世代的效應

Lashermes等[14]以Stock6作父本，以169wx/Syn421、148uh/S112、1233wx/Syn115等3個組合的F1代作母本，比較了F2及F3世代的的單倍體誘導率，認為F2與F3世代間誘導率的相關性只有0.59。李國良等[11]用農大高誘1號對同一群體不同世代間的單倍體誘導率進行了研究，認為早代S1代為最佳的單倍體誘導世代。本研究也得出了類似結論：在不同類群的高世代中，S4、S5世代單倍體誘導率顯著高于S1、S2和S3世代，但每株獲得的單倍體粒數(shù)卻低于后者；S1世代單倍體誘導率較低，但收獲的材料、結實率高，實際獲得的單倍體數(shù)量在不同類群中均位于前列。S1世代是植株性狀急劇分離的世代，可以通過植株抗病性、株高等田間農藝性狀去除一些偽單倍體植株，選擇一些比較優(yōu)良的單株進行誘導獲得單倍體，這可以大大減少工作量，提高優(yōu)良單倍體出現(xiàn)的概率，因此本研究認為S1世代為單倍體最佳誘導世代。

3.3 誘導環(huán)境的優(yōu)化

Prigge等[15]在溫帶和熱帶地區(qū)進行單倍體誘導認為，2種環(huán)境下單倍體的誘導率具有顯著差異，但Eder等[16]對12份基礎材料在兩種不同的生態(tài)環(huán)境下誘導認為，不同環(huán)境條件下單倍體誘導率差異不大。黎亮等[7]多年的試驗結果證實，在海南冬季進行單倍體誘導的效率顯著高于北京夏季。本研究選取了長春和三亞2個試驗點進行研究，結果發(fā)現(xiàn)三亞冬季的誘導率顯著高于長春夏季，這種差異可能源于兩地的氣候因素。長春夏季氣溫較高，三亞冬季氣溫較低且晝夜溫差大，而氣溫較低的情況下可能更適合于籽粒發(fā)育及色素標記基因的表達，因此選擇適宜的單倍體誘導地點或者環(huán)境，諸如海南三亞，將更有利于提高單倍體的誘導率。

3.4 誘導時間和果穗部位的選擇

授粉時期對單倍體的誘導率也有重要影響。Chase[13]、Seaney[17]的研究均表明，延遲授粉可以提高玉米單倍體誘導率。慈佳賓[18]的研究結果表明，長花絲條件下的單倍體誘導率優(yōu)于短花絲條件下的誘導率，認為延遲授粉是其原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，果穗頂部籽粒的單倍體誘導率高于底部籽粒，這與Sarkar等[19]、Chalyk[20]的研究結果相類似，其原因可能與卵細胞成熟的不同步、營養(yǎng)功能的變化、某些外界因子的局部影響，或者所有因素共同起作用相關。本研究表明，早期授粉的單倍體誘導率高于晚期授粉，此現(xiàn)象尚無法用花絲長短進行解釋。Rotarenco等[21]認為，早期授粉的單倍體誘導率高與異雄核受精有關，由于吐絲時間長的花絲直徑更大，可以容納更多的花粉管生長，單受精的概率可能降低，進而影響單倍體出現(xiàn)的概率。據(jù)此推測，不同生態(tài)環(huán)境下單倍體誘導率的差異也可能與花絲自身結構以及花粉的活力有關。

4 結束語

高效地進行單倍體誘導對于單倍體育種至關重要。特別是大規(guī)模的單倍體育種工作的開展，更需要從系統(tǒng)化和工程化角度進行技術優(yōu)化。由于誘導效率受母本材料、地點環(huán)境等因素影響，在誘導技術優(yōu)化過程中，系統(tǒng)地利用高頻誘導材料、高頻誘導地點、高頻誘導時間將有利于單倍體育種技術系統(tǒng)效率的提高，也有利于單倍體育種工程化特別是專業(yè)化和基地化的發(fā)展。當然，隨著單倍體育種技術的普及和規(guī)?；瘧?，仍然需要探索更加完善的單倍體誘導優(yōu)化方案，從而為單倍體育種工程化的實現(xiàn)提供理論依據(jù)。

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Study onin-vivohaploid inducing efficiency in maize

LIU Xiao-xin,CI Jia-bin,CUI Xue-yu,ZHANG Ye,ZHAO Chao,YANG Wei-guang

(AgronomyCollege,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study analyzed the change in inducing rate of maize haploid with different processing factors to propose new technique with efficient induction rate.【Method】 Effects of five factors including of genotype of female parent,generation selection,ecological environment,pollination stage,and ear position on maize haploid inducing rate were analyzed.【Result】 The haploid induction rates of different female parents were significantly different but the relationship between crossing pattern and induction rate was insignificant.S1was the optimal induced haploid generation for five germplasm types.Compared with Changchun,it was better to increase the haploid inducing rate in Sanya.Early pollination had higher haploid inducing rate than late pollination and lower part of ear had the higher haploid inducing rate than top of ear.【Conclusion】 To increase maize haploid inducing rate and optimize the haploid induction,female parents with high frequency,suitable genotype and S1generation should be selected,and induction should be conducted in location with stable environment at early stage of silking.

maize;doubled haploid breeding;inducing rate

2013-12-04

國家“863”計劃項目(2011AA10A103)；國家科技計劃項目(2011BAD35B01)；農業(yè)部“948”項目(2011-G1-21)

劉曉鑫(1980-)，女，吉林雙遼人，在讀博士，主要從事玉米遺傳育種研究。 E-mail:32120897 @qq.com

楊偉光(1960-)，男，吉林梨樹人，教授，博士生導師，主要從事玉米遺傳育種研究。E-mail:ywg789@126.com

時間:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.032

S513.032

A

1671-9387(2015)04-0035-09

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.032.html