重鉻酸鉀對昆明小鼠肝腎毒性的影響

付 婧，劉燕群，2，熊 旭，劉 潔，何志文，魯雄兵，陳曉青，陳朝霞

（1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430056；2.江漢大學(xué)光電化學(xué)材料與器件省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢430056）

重鉻酸鉀對昆明小鼠肝腎毒性的影響

付 婧1，劉燕群1，2，熊 旭1，劉 潔1，何志文1，魯雄兵1，陳曉青1，陳朝霞1

（1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430056；2.江漢大學(xué)光電化學(xué)材料與器件省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢430056）

目的 應(yīng)用組織學(xué)方法研究不同濃度六價鉻對昆明小鼠肝腎毒性的影響，觀察小鼠生理狀態(tài)的改變及肝臟和腎臟的病理變化。方法 將體質(zhì)量、毛色、生理狀態(tài)相似的60只昆明小鼠分為六組（其中一組進行預(yù)實驗，另五組進行正式實驗），每組10只，雌雄各5只，分別用濃度為0.00、0.32、0.64、1.28、2.56 mg/kg的重鉻酸鉀溶液給予五組小鼠灌胃，每天 1次，連續(xù)灌胃染毒1個月后，解剖取其肝臟、腎臟，用蘇木精-伊紅染色法制成切片，觀察其病理結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 隨著重鉻酸鉀濃度的增加和染毒時間的延長，小鼠的活動能力變?nèi)?、精神狀態(tài)變差。解剖后，40倍顯微鏡下觀察結(jié)果顯示小鼠肝臟、腎臟病變明顯，有出血現(xiàn)象，細(xì)胞異形性明顯，部分細(xì)胞壞死。結(jié)論 重鉻酸鉀對昆明小鼠肝腎具有明顯的毒性作用，其誘導(dǎo)小鼠的肝腎組織產(chǎn)生病變，且濃度越高作用越強。

毒物； 肝/損傷； 腎/損傷； 重鉻酸鉀； 小鼠

鉻被廣泛應(yīng)用于人們的生活中，金屬冶煉、皮革制造、化妝品生產(chǎn)、人工關(guān)節(jié)等多個行業(yè)均會應(yīng)用到金屬鉻[1]。鉻很容易被人體吸收，可以經(jīng)過消化道、呼吸道、皮膚及黏膜等多種途徑侵入人體，并在人體內(nèi)蓄積，對人的肝、肺、腎等內(nèi)臟器官和DNA造成損傷，引起潰瘍、肺癌、皮膚病、黏膜發(fā)炎等多種疾病[2]，甚至危害人體的骨骼系統(tǒng)，影響兒童的骨骼發(fā)育[3]。有研究表明，六價鉻對人體毒性作用強，攝入過量會引起相應(yīng)并發(fā)癥，肝臟和腎臟受損，大量攝入鉻會造成致癌、致突變等不良影響[4]。

昆明小鼠繁殖能力強，存活能力高，抗病力強，適應(yīng)性強，被廣泛應(yīng)用于藥理、病理學(xué)研究。肝臟是人體主要的解毒器官，腎臟是人體主要的排泄器官[5-10]。本研究通過觀察重鉻酸鉀對昆明小鼠肝腎的毒性影響，探討六價鉻對人體的毒性效應(yīng)及六價鉻引起的相關(guān)疾病的治療，以期為醫(yī)學(xué)和環(huán)境學(xué)家提供相關(guān)的重金屬毒性資料，為重金屬毒性的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選?。?5±1）d斷乳清潔級昆明小鼠60只，雌雄各30只，購于湖北省實驗動物研究中心（批號：42000600003918）。小鼠毛色純白有光澤，體格健壯，體質(zhì)量 25.00 g左右。于室溫（24±1）℃下適應(yīng)性培養(yǎng)5 d，自由取水，每只小鼠喂食5 g鼠糧。5 d后，稱取其體質(zhì)量，將60只昆明小鼠根據(jù)體質(zhì)量差異隨機分為六組，每組10只，雌、雄各5只，使每組小鼠的平均體質(zhì)量為30.00 g左右。

1.1.2 儀器與試劑 PH100-3A41L-EP生物顯微鏡（江西鳳凰光學(xué)集團有限公司）、JA2003B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、重鉻酸鉀（K2Cr2O7）、分析純（上海亭新化工試劑廠，批號：20080901）等。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性實驗

1.2.1.1 預(yù)實驗 在正式實驗前，任選一組小鼠進行預(yù)實驗，該組小鼠平均體質(zhì)量28.58 g。六價鉻對昆明小鼠的半數(shù)致死濃度為171.00 mg/kg[4]。故以2倍的半數(shù)致死量為上限，0為下限，設(shè)置10個濃度梯度。分別將19.55、9.77、4.88、2.44、1.22、0.61、0.30、0.15、0.07、0.00 mg/mL的重鉻酸鉀溶液給10只昆明小鼠灌胃，每次灌胃量為0.5mL，每6小時灌胃1次，連續(xù)灌胃4次。持續(xù)觀察小鼠的生活狀態(tài)，找出能使小鼠中毒又不致死的適宜濃度，選取4個濃度作為正式實驗的灌胃濃度。因濃度最大的2只小鼠在第1次灌胃后半小時內(nèi)即死亡，其余小鼠未死亡，而3號小鼠精神萎靡，毛色發(fā)黃，生活狀態(tài)不佳，故以4號小鼠（2.44 mg/mL）為最大濃度。選取0.30、0.61、1.22、2.44 mg/mL 4個濃度，以及0.00 mg/mL對照組進行正式實驗。

1.2.1.2 正式實驗 將50只昆明小鼠分為五組，每組10只，雌雄各 5只，在室溫下分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食。配制濃度為0.32、0.64、1.28、2.56 mg/mL的4瓶重鉻酸鉀母液，于4℃冰箱內(nèi)避光儲存?zhèn)溆谩φ战M用生理鹽水灌胃。給五組小鼠每天灌胃1次，持續(xù)灌胃1個月。每天觀察小鼠的生活狀態(tài)、活躍情況、體表特征，記錄小鼠體質(zhì)量變化情況。最后1次灌胃后，自由飲水，禁食24 h后，處死全部小鼠，采集標(biāo)本。

1.2.2 肝腎蘇木精-伊紅（HE）切片的制作 解剖所有小鼠，取其肝臟和腎臟組織塊，稱取質(zhì)量后，投入預(yù)先配好的4%甲醛溶液中固定，保持細(xì)胞原本形態(tài)，使組織、細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性凝固，以防止細(xì)胞死亡后自溶或細(xì)菌分解。乙醇脫水：由低濃度到高濃度的乙醇作脫水劑逐漸脫去組織塊中的水分，再將組織塊置于既溶于乙醇又溶于石蠟的二甲苯中，以置換出乙醇。石蠟包埋：將脫水透明好的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入石蠟箱中保溫，使石蠟完全侵入組織塊內(nèi)，然后迅速夾取浸透石蠟的組織塊放入已倒入溶化的石蠟小紙盒內(nèi)，使其冷卻凝固成塊。切片：將包埋好的蠟塊用切片機切成5～8 μm的薄片，貼于載玻片上，于45℃恒溫箱內(nèi)烘干。二甲苯脫蠟：用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度的乙醇，最后加入蒸餾水。HE染色，先將切片置于HE溶液中染色幾分鐘，再置于酸水和氨水中分色各幾秒，用流水沖洗1 h后加入蒸餾水片刻，置于70%、90%乙醇中脫水各10 min，最后用HE染液染色3min，樹膠封片。染色后的切片經(jīng)乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯透明，然后滴上樹膠，蓋上蓋玻片封固，制成肝腎HE切片。待樹膠干后，即可于顯微鏡下觀察[5-6]。

2 結(jié) 果

2.1 一般觀察情況 對照組小鼠生活狀態(tài)良好，體格健壯，毛色純白，活潑好動，反應(yīng)迅速，食欲正常，體質(zhì)量不斷增加。重鉻酸鉀濃度最高組小鼠食欲減退，較為安靜，體質(zhì)量增長最為緩慢，增長率低于對照組，且有2只小鼠死亡。其余組小鼠體質(zhì)量增長均較對照組慢，但無小鼠死亡。隨染毒天數(shù)的增加，不同重鉻酸鉀濃度組小鼠精神萎靡，食欲下降，毛色由純白有光澤變得偏黃、無光澤，且濃度越高變化越明顯，小鼠生長越來越遲緩，體質(zhì)量增加減慢。且解剖小鼠后觀察到肝腎增大，肝臟顏色不鮮紅且色澤不均，并伴暗色邊緣，表現(xiàn)出毒性病理特征。部分小鼠肝臟、腎臟變黑，病變格外明顯。

2.2 顯微鏡觀察 HE切片結(jié)果顯示，經(jīng)過1個月的灌胃染毒后，昆明小鼠的肝臟、腎臟出現(xiàn)了一定程度的病變。肝細(xì)胞呈多面體形，細(xì)胞核大而圓，染色質(zhì)豐富,中央靜脈周圍是大致呈放射狀排列的肝索和肝血竇（圖1A）。肝細(xì)胞點狀壞死，有炎癥細(xì)胞滲出（圖1B）。中濃度組出現(xiàn)中央靜脈偏移、畸形現(xiàn)象，出血現(xiàn)象明顯，部分細(xì)胞壞死，細(xì)胞核碎裂溶解，肝細(xì)胞界限不清(圖1C)。高濃度組細(xì)胞水腫，排列散亂，變異程度高，胞漿呈顆粒狀，并含大量大小不等顆粒性脂滴（圖1D）。腎小管上皮水腫，管腔變窄，腎髓質(zhì)部分彌漫性水腫，血管周圍紅細(xì)胞滲出，并伴有炎性細(xì)胞的滲出，間質(zhì)血管擴張、充血、出血。高劑量組大量細(xì)胞死亡，胞質(zhì)疏松，腎小管上皮細(xì)胞溶解脫落（圖2）。

圖1 不同濃度K2Cr2O7處理1個月后小鼠肝臟的組織病理學(xué)改變情況（40×）

圖2 不同濃度K2Cr2O7處理1個月后小鼠腎臟的組織病理學(xué)改變情況（40×）

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，隨染毒劑量的增加，小鼠的狀態(tài)不佳，肝腎病變更加明顯，表明六價鉻對昆明小鼠有比較明顯的致病效應(yīng)，且存在劑量效應(yīng)。小鼠的病變情況與性別無關(guān)，雌雄個體均有病變，且病變程度無明顯差異。

從圖1可見，重鉻酸鉀染毒組小鼠肝臟出現(xiàn)了炎癥細(xì)胞、壞死細(xì)胞，提示重鉻酸鉀對昆明小鼠肝細(xì)胞病變存在較強誘導(dǎo)。從圖2可見，小鼠腎臟的病變主要出現(xiàn)在腎小管處，腎小球部病變不明顯。隨六價鉻濃度的升高，腎小管上皮水腫，管腔變窄，腎髓質(zhì)部分彌漫性水腫，血管周圍紅細(xì)胞滲出，并伴炎癥細(xì)胞的滲出，間質(zhì)血管擴張充血、出血，與孫姣姣[11]研究結(jié)果一致。高濃度組大量細(xì)胞死亡，細(xì)胞質(zhì)疏松，腎小管上皮細(xì)胞溶解脫落。說明六價鉻有誘導(dǎo)肝腎細(xì)胞病變的作用。

本實驗結(jié)果證實，重鉻酸鉀對昆明小鼠具有毒性效應(yīng)，且對小鼠的肝腎毒性作用明顯。說明重鉻酸鉀在昆明小鼠體內(nèi)無法自身完全分解代謝，無法通過小鼠消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)完全排出體外。重鉻酸鉀的攝入和累積使昆明小鼠食欲缺乏、精神萎靡，并引起小鼠肝腎的病變。本實驗結(jié)果為進一步研究六價鉻對小鼠肝腎的毒性影響提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)，為六價鉻的毒性實驗研究提供了理論依據(jù)，為進一步實驗奠定基礎(chǔ)。

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Toxic effect of potassium bichromate on liver and kidney in Kunming mice

Fu Qian1，Liu Yanqun1，2，Xiong Xu1，Liu Jie1，He Zhiwen1，Lu Xiongbin1，Chen Xiaoqing1，Chen Zhaoxia1
（1.College of Medicine，Jianghan University，Wuhan，Hubei 430056，China；2.Province-Ministry Co-Construct Key Laboratory of Optoelectronic Chemical Materials and Devices of Ministry of Education，Jianghan University，Wuhan，Hubei 430056，China）

Objective To study the toxic effect of different concentrations of hexavalent chromium on the liver and kidney of Kunming mice，and to observe the changes of physiologic status and the pathologic changes of their kidney and liver.Methods 60 Kunming mice with the similar body mass，hair color and physiologic status were randomly divided into 6 groups（conducting the pre-experiment in one group and formal experiment in other 5 groups），10 cases in each group，half male and half female.The potassium bichromate solution at concentration of 0.00，0.32，0.64，1.28，2.56 mg/kg was gavaged in 5 groups，once daily.After 30 d continuous gavage for contacting toxicity，the liver and kidney were taken and stained by hematoxylin and eosin（HE）for preparing the sections.Then the pathologic structure changes were observed.Results Along with the increase of potassium bichromate concentration and extending of contacting toxicity time，the mice′activity capability was decreased and their mental state came to be worse.After anatomy，the pathologic changes of the liver and kidney were obvious，such as bleeding phenomena，apparently heteromorphic cells and partially necrotic cells under the 40 fold microscope.Conclusion Potassium bichromate has obvious toxic effect on the liver and kidney of Kunming mice，which induces the liver and renal tissues to generate the lesion，moreover the higher the concentration，the stronger the toxic effect.

Poisons； Liver/injuries； Kidney/injuries； Potassium dichromate； Mice

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.009

A

1009-5519（2015）21-3230-02

2015-07-07）

湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊項目（T201224）；江漢大學(xué)學(xué)生科研項目（2015）。

付婧（1995-），女，湖北武漢人，主要從事公共衛(wèi)生方面的研究；E-mail：xxfujing@163.com。

劉燕群（E-mail：nanyan85@126.com）。