針康法對(duì)腦缺血大鼠腦組織VEGF、LN 表達(dá)的影響*

朱路文，唐 強(qiáng)，李 季，趙 彬，陳慧杰

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001)

缺血性卒中(ischemic stroke)約占全部腦卒中的70%，其發(fā)病率、致殘率和致死率高。腦缺血后常伴有運(yùn)動(dòng)障礙、感覺(jué)障礙、認(rèn)知功能障礙等，嚴(yán)重影響了患者的日常生活。針康法是腦卒中康復(fù)的新策略，是頭穴叢刺與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，具有針刺康復(fù)同步、動(dòng)態(tài)治療的特點(diǎn)［1］。前期研究表明，針康法能減輕缺血腦組織水腫，增加缺血周邊區(qū)突觸數(shù)目，升高腦缺血區(qū)皮層GAP-43 表達(dá)，降低Nogo-A 表達(dá)［2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種促血管新生因子，對(duì)局灶性腦缺血神經(jīng)功能缺損改善作用明顯。層粘連蛋白(Laminin，LN)變化可直接導(dǎo)致血腦屏障通透性的改變［3］，在腦缺血中有維持血管完整性、防止腦水腫及繼發(fā)性神經(jīng)元損傷的作用［4］。本研究觀察腦缺血后及針康法干預(yù)后腦組織VEGF 及LN 的變化，探討針康法治療缺血性腦卒中的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)Sprague- Dawley(SD)雄性大鼠，體重(250 ±30)g，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為SYXK(黑)2010007。飼養(yǎng)條件:SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)中心，大鼠可自由進(jìn)食、飲水，室溫控制在20℃～25℃，濕度保持50% ～60%，明暗光照12 h晝夜循環(huán)。

隨機(jī)將90 只大鼠分成模型組、假手術(shù)組、針刺組、康復(fù)組及針康組5 組，每組按術(shù)后3 天、7 天、14 天時(shí)間點(diǎn)再分為3 個(gè)亞組，每個(gè)亞組6 只。實(shí)驗(yàn)處置符合小動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑

RM2265 型切片(德國(guó)Leica);HI1210 型攤片機(jī)(德國(guó)Leica);DHG-9030A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(中國(guó)上海);兔抗大鼠VEGF 多克隆抗體(武漢博士德);兔抗大鼠LN 多克隆抗體(武漢博士德)。

1.3 模型制備

采用阻閉大鼠大腦中動(dòng)脈(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)誘導(dǎo)永久性局灶性腦缺血。術(shù)前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛麻醉，術(shù)中動(dòng)物保持自主呼吸，恒溫加熱板保持大鼠體溫恒定(37. 0 ±0.5℃)。頸部常規(guī)消毒，頸部正中切口，暴露大鼠頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈以及頸內(nèi)動(dòng)脈，將頸總及頸外動(dòng)脈結(jié)扎，在頸總動(dòng)脈分叉部的下方使用眼科剪剪一小切口，將尼龍單纖絲線(xiàn)(Japan)一末端烤成約2.6 cm 的圓頭插入頸內(nèi)動(dòng)脈17 ～18 mm，完全阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。假手術(shù)組大鼠手術(shù)方法同模型組，但線(xiàn)栓僅從頸總動(dòng)脈插入約10 mm，不能阻斷大腦中動(dòng)脈血流供應(yīng)。術(shù)后6 h 采用改良的Bederson 標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1 ～3 分的pMCAO 大鼠納入本實(shí)驗(yàn)。

1.4 干預(yù)方法

模型組:造模后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療，只予以同等條件抓取。

假手術(shù)組:造模后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療，只予以同等條件抓取。

針刺組:造模后24 h，采用頭穴叢刺針?lè)ㄖ委?。參照前期?shí)驗(yàn)研究，采用1.0 寸針灸針，取百會(huì)穴及百會(huì)左、右側(cè)各旁開(kāi)2 mm 處針刺，快速捻轉(zhuǎn)1 min 后留針2 h，每日1 次。

康復(fù)組:造模后24 h，采用跑臺(tái)訓(xùn)練模擬臨床康復(fù)治療(在造模前均經(jīng)過(guò)適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練3 天，每天10 min，速度為15 m/min)。參照前期預(yù)實(shí)驗(yàn)形成的方案:時(shí)間:30 min/天;速度:1 ～3 天8 m/min，4 ～7 天12 m/min，7 天后15 m/min;坡度:0°;1 次/天。

針康組:造模后24 h，采用針康法治療。針康法參照［6］，頭穴叢刺留針期間進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，針刺方案同針刺組、跑臺(tái)方案同康復(fù)組，每日1 次。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)方法

術(shù)后3 天、7 天、14 天，大鼠以10%水合氯醛麻醉，0.9%生理鹽水200 ml、4%多聚甲醛200 ml 灌注。分離缺血側(cè)腦組織，4%多聚甲醛PBS 溶液中固定48 h后，取視交叉和其后4 mm 處兩點(diǎn)，切取腦冠狀薄片，厚度約4 mm，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4 ～6 μm，免疫組織化學(xué)染色。

采用免疫組化PV 二步法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、層粘連蛋白(LN)在缺血半暗區(qū)皮層的表達(dá)，具體方法參照試劑盒。每只大鼠取相同部位連續(xù)切片5 張，顯微鏡在10 ×40 倍下對(duì)視野中VEGF、LN陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠缺血半暗區(qū)皮層血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)

假手術(shù)組可見(jiàn)少量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞胞體小，突起細(xì)。腦缺血后，VEGF 陽(yáng)性表達(dá)增多，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，先增加后降低，與假手術(shù)組比較差異顯著(P ＜0.05)。采用針康法、針刺、康復(fù)訓(xùn)練干預(yù)后，缺血腦組織VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，說(shuō)明針刺、康復(fù)訓(xùn)練、針康法均能促進(jìn)腦缺血后血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。術(shù)后7 天、14 天，與模型組相比，康復(fù)組、針刺組與針康組VEGF 陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)(P ＜0.05);與康復(fù)組、針刺組比較，針康組VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多(P ＜0.05)。以上結(jié)果表明，針康法能啟動(dòng)腦缺血后內(nèi)源機(jī)制，促進(jìn)VEGF 陽(yáng)性表達(dá)，優(yōu)于單純康復(fù)和針刺。見(jiàn)圖1。

圖1 VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖

2.2 各組大鼠缺血半暗區(qū)皮層層粘連蛋白(LN)的表達(dá)

假手術(shù)組LN 陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)，鏡下可見(jiàn)大量LN 陽(yáng)性細(xì)胞，呈裂隙狀或條索狀。模型組LN 陽(yáng)性表達(dá)較低，與假手術(shù)組比較，差異顯著(P ＜0.05)，表明腦缺血后血腦屏障受損，LN 的表達(dá)下降。隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，LN 的表達(dá)逐漸增加。術(shù)后7 天、14 天，康復(fù)組、針刺組與針康組LN 陽(yáng)性表達(dá)較模型組增強(qiáng)(P ＜0.05);與康復(fù)組、針刺組比較，針康組LN 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P ＜0.05)。以上結(jié)果表明，針刺、康復(fù)訓(xùn)練、針康法干預(yù)均能促進(jìn)LN 陽(yáng)性表達(dá)，改善血腦屏障的通透性，針康法的治療優(yōu)勢(shì)更明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 LN 陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

針康法是頭穴叢刺與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，具有“針康同步、動(dòng)態(tài)治療、整體康復(fù)”的特點(diǎn)。在針康法的核心內(nèi)容中，頭穴叢刺的效應(yīng)能夠透過(guò)顱骨，刺激大腦皮層，直達(dá)責(zé)任病灶;康復(fù)訓(xùn)練作用于四肢，通過(guò)多次重復(fù)的動(dòng)作，非侵入性刺激中樞系統(tǒng)，提高腦結(jié)構(gòu)、功能的可塑性，兩者雙向調(diào)節(jié)、同時(shí)作用，促進(jìn)受損腦功能的恢復(fù)。

VEGF 又名血管通透性因子，是一種特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞表面受體的血管生成因子，具有維持血管通透性、誘導(dǎo)血管發(fā)生的作用。腦缺血、缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)源性VEGF 表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖，縮小腦梗死體積;血管表皮生長(zhǎng)因子受體(VEGF-R)通過(guò)多種信號(hào)途徑介導(dǎo)微血管及神經(jīng)再生，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化，發(fā)揮腦保護(hù)作用［7］。本實(shí)驗(yàn)中，各時(shí)間點(diǎn)模型組VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組增加，差異顯著(P ＜0.05)，說(shuō)明腦缺血啟動(dòng)內(nèi)源性機(jī)制促進(jìn)VEGF 陽(yáng)性表達(dá)，修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞。各時(shí)間點(diǎn)，針刺組、康復(fù)組及針康組VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均明顯高于模型組，說(shuō)明3 種干預(yù)方法均能激活神經(jīng)血管單元中的血管內(nèi)皮保護(hù)因子;陳鵬典等［8］證明了督脈電針聯(lián)合人臍血MSCs 移植具有協(xié)同效應(yīng)，可上調(diào)缺血區(qū)半暗帶VEGF 表達(dá)，促進(jìn)血管新生，與本研究結(jié)果相一致。術(shù)后7 天、14 天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，針康組VEGF 陽(yáng)性表達(dá)明顯高于針刺組及康復(fù)組(P ＜0.05)，這表明針康法可上調(diào)VEGF 陽(yáng)性表達(dá)，在促進(jìn)腦缺血后微血管修復(fù)上優(yōu)于單純針刺及康復(fù)。

血腦屏障是腦組織最重要的防御結(jié)構(gòu)之一，其通透性發(fā)生改變將影響神經(jīng)元的存活。LN 是一種大型的糖蛋白，是胚胎發(fā)育中出現(xiàn)最早的細(xì)胞外基質(zhì)成分［3］，與Ⅳ型膠原一起構(gòu)成基膜，參與組成血腦屏障，缺血后它的一系列變化將直接改變血腦屏障通透性。細(xì)胞表面的特異性受體與層粘連蛋白結(jié)合，細(xì)胞與基底膜結(jié)合成為一個(gè)緊密體，起到保護(hù)、過(guò)濾的作用，并決定細(xì)胞的極性，影響細(xì)胞的代謝、存活、遷移、增殖和分化［4］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血后LN 蛋白的表達(dá)增加，恢復(fù)血腦屏障通透性，同時(shí)與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化以及軸突的生長(zhǎng)。針康法、針刺、康復(fù)干預(yù)后LN 的表達(dá)較模型組明顯上調(diào)，說(shuō)明這3 種方法都能通過(guò)恢復(fù)血腦屏障通透性發(fā)揮腦保護(hù)作用，但針康法上調(diào)LN 的表達(dá)更加明顯，在保護(hù)血腦屏障上的優(yōu)勢(shì)更突出。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明針康法能促進(jìn)腦缺血區(qū)半暗區(qū)VEGF、LN 的表達(dá)，從而促進(jìn)腦缺血后微血管的再生，改善血腦屏障的通透性。

［1］ 唐強(qiáng).頭穴叢刺與康復(fù)治療的有機(jī)結(jié)合［J］. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2011，17(4):301-303

［2］ 唐強(qiáng)，朱路文，邢艷麗，等.針康法對(duì)腦缺血大鼠運(yùn)動(dòng)功能及GAP-43、Nogo-A 表達(dá)的影響［J］.針灸臨床雜志，2015，31(1):54-7

［3］ 胡曉松，周東，唐瑜，等. 層粘連蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-9 在大鼠局灶性腦缺血梗死區(qū)周?chē)谋磉_(dá)及意義［J］. 華西醫(yī)學(xué)，2013，28(5):651-654

［4］ LEE H，PARK J- W，KIM S- P，et al. Doxycycline inhibits matrix metalloproteinase- 9 and laminin degradation after transient global cerebral ischemia［J］.Neurobiol Dis，2009，34(2):189-198

［5］ BEDERSON JB，PITTS LH，TSUJI M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472-6

［6］ 唐強(qiáng)，劉宏光，王艷，等.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠前肢運(yùn)動(dòng)功能及缺血區(qū)突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43 表達(dá)的影響［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2011，17(10):973-6

［7］ 姚瑞芹，李林.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在缺血性腦損傷中血管新生，神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)的作用［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2007，13(3):208-11

［8］ 陳鵬典，楊卓欣，于海波，等. 督脈電針聯(lián)合人臍血MSCs 移植對(duì)腦缺血大鼠VEGF 蛋白表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32(6):1261-3