項(xiàng)部針刺對動(dòng)脈粥樣硬化兔斑塊內(nèi)新生血管影響的實(shí)驗(yàn)研究*

萬 征，王 蕾，周海純

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150000)

動(dòng)脈粥樣硬化與心腦血管事件密切相關(guān)，近年來大量研究集中在觀測動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)內(nèi)-中膜厚度及狹窄程度等方面。目前醫(yī)學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)AS 斑塊的不穩(wěn)定性是臨床事件突發(fā)的更直接原因。所以目前醫(yī)學(xué)界將確診“不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊”視為研究的熱點(diǎn)［1］。隨著超聲造影劑的廣泛使用，超聲造影技術(shù)得以迅速發(fā)展，目前使用超聲造影技術(shù)觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的新生血管成為可能，而這些新生血管就是影響斑塊穩(wěn)定性的直接原因。因此本研究筆者采用超聲造影定量分析技術(shù)及免疫組化為評價(jià)觀察指標(biāo)，研究項(xiàng)部針刺治療對動(dòng)脈粥樣硬化的改善作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物造模［2］

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康雄性新西蘭兔32 只(上海斯萊克責(zé)任公司，SCXK2013-0003)，體重(2.2 ±0.3 kg)。單籠高脂飲食飼養(yǎng)。采用數(shù)字表法隨機(jī)編號。

1.1.2 飼養(yǎng)方式 飼料配方普通飼料占83.5%，蛋黃粉含量7.5%，混入豬油占8%以及1%膽固醇共同組成。每只動(dòng)物攝入配方飼料量100 g/日，日2 次喂食，可自由加食普通飼料及飲用水。

1.1.3 入組標(biāo)準(zhǔn) 高脂喂養(yǎng)后3 ～4 個(gè)月后，常規(guī)超聲觀察兔腹主動(dòng)脈，正常腹主動(dòng)脈內(nèi)壁光滑，AS 顯示動(dòng)脈管壁內(nèi)-中膜增厚，局部隆起甚至多發(fā)斑塊形成。見圖1 ～2。

圖1 超聲示正常腹主動(dòng)脈

圖2 超聲示AS 入組腹主動(dòng)脈

1.2 分組治療

采用數(shù)字表法隨機(jī)編號，隨機(jī)分為項(xiàng)針組(編號奇數(shù))、對照組(編號偶數(shù))，每組10 例。另外按照入組標(biāo)準(zhǔn)建立模型組試驗(yàn)動(dòng)物10 只。對照組予阿托伐他汀(生產(chǎn)廠家:輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20051407)5 mg/Kg/d，水溶后灌胃，1 次/日。項(xiàng)針組在1 次/日阿托伐他汀5 mg/Kg/d 水溶后灌胃給藥基礎(chǔ)上，參考《實(shí)用動(dòng)物針灸手冊》(第2 版)選擇左右風(fēng)池穴、左右供血穴，電極分別接在兩側(cè)穴位上，每次30 min，應(yīng)用上海醫(yī)療器械廠66805-II 電針儀，選擇連續(xù)波，頻率值設(shè)為5 Hz。模型組予常規(guī)飼養(yǎng)不予治療。治療30 天為時(shí)間點(diǎn)。

1.3 設(shè)備選擇

SonoVue 超聲造影劑(Braco，Italy)，配置混懸液，微泡濃度配置值2 ×108個(gè)/ml，滲透壓值2900 sm/kg，微泡平均直徑2.5 μm，90%的微泡直徑小于8 μm;彩色超聲診斷儀型號Philips iU22，聚焦深度置于腹主動(dòng)脈深部，高頻探頭L9-3，機(jī)械指數(shù)0.07、增益90%;超聲圖像定量分析軟件:Philips 軟件產(chǎn)品，PC 工作站上能夠脫機(jī)使用，進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析。

1.4 檢查方法

對入組動(dòng)物檢查，選擇體積大、位置明顯的AS 斑塊記錄，注意避免選擇硬斑，對模型動(dòng)物肌肉注射麻醉，選用麻醉藥品為氯胺酮，濃度為10 mg/kg;安定濃度為5 mg/kg。造影劑耳緣靜脈團(tuán)注，注入0. 2 ml/次，后追加注射9%氯化鈉液體1 ml。注射同時(shí)采集圖像并存儲［3］。描繪感興趣區(qū)(ROI)，生成時(shí)間-強(qiáng)度曲線定量分析造影后的峰值強(qiáng)度與基礎(chǔ)強(qiáng)度差值EI，同時(shí)計(jì)算ratio［4-5］。

1.5 免疫化學(xué)染色

對斑塊內(nèi)的微血管染色，采用免疫組學(xué)法，BenchmarkXT 免疫組化染色機(jī)染色，顯示動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的第八因子相關(guān)F8 抗原，F(xiàn)8 抗原具有結(jié)合微血管上皮細(xì)胞內(nèi)的抗原的特異性，細(xì)胞胞漿著色后顯示棕黃色［5］，使用CMIAS2001A 型圖片管理系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，測量陽性細(xì)胞棕黃色反應(yīng)物的積分光度，分析F8 抗原的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選擇SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料采用配對t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)改變

圖3 正常組織HE 染色(×20 倍)

由圖3、圖4 可見，血管內(nèi)皮明顯增厚，可見異常斑塊隆起及脂肪空泡。光鏡下可見纖維組織，并且纖維組織發(fā)生斷裂、溶解，平滑肌細(xì)胞中內(nèi)膜明顯變薄，周圍存在毛細(xì)血管增生。

2.2 斑塊EI 定量分析

圖4 動(dòng)脈粥樣硬化HE 染色(×20 倍)

見表1。療前各組比較P ＞0.05，療后項(xiàng)針組與模型組比較P ＜0.01，項(xiàng)針組與對照組比較P ＜0.05，對照組予模型組比較P ＜0.01。

表1 斑塊EI 定量分析結(jié)果(±s)

表1 斑塊EI 定量分析結(jié)果(±s)

組別 例數(shù) 療前 療后項(xiàng)針組10 5.71 ±0.24 4.05 ±0.30對照組 10 5.82 ±0.22 4.40 ±0.24模型組10 5.76 ±0.24 5.30 ±0.46

2.3 斑塊Ratio 定量分析

見表2。療前各組比較P ＞0.05，療后項(xiàng)針組與模型組比較P ＜0.01，項(xiàng)針組與對照組比較P ＜0.05，對照組與模型組比較P ＜0.01。

表2 斑塊Ratio 定量分析結(jié)果

2.4 斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的第八因子相關(guān)F8 抗原定量分析

見表3。療前各組比較P ＞0.05，療后項(xiàng)針組與模型組比較P ＜0.01，項(xiàng)針組與對照組比較P ＜0.01，對照組與模型組比較P ＜0.01。

表3 F8 抗原定量分析結(jié)果

從表1 ～表3 可見，療前各組斑塊及斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的第八因子相關(guān)F8 抗原統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P均＞0.05，說明各組指標(biāo)療前具有可比性。療后1 個(gè)月觀察各組斑塊及斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的第八因子相關(guān)F8 抗原發(fā)現(xiàn)，各組與療前比較均有所改善，說明阿托伐他汀灌藥及項(xiàng)針治療結(jié)合阿托伐他汀灌藥的治療方法均能夠抑制斑塊及斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的第八因子相關(guān)F8 抗原的形成，并均能夠抑制斑塊內(nèi)新生血管形成，從而增加斑塊的穩(wěn)定性，避免心腦血管疾病的發(fā)生，但是兩組對比分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果證實(shí)項(xiàng)針治療結(jié)合阿托伐他汀灌藥的治療方法明顯優(yōu)于單獨(dú)阿托伐他汀灌藥的治療方法(P ＜0.05 或P ＜0.01)。因此可以證實(shí)項(xiàng)部電針治療能夠在一定程度上抑制動(dòng)脈硬化斑塊的形成，促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定性。

3 討論

AS 斑塊形成、發(fā)展過程中均可見斑塊內(nèi)新生血管，正常情況下動(dòng)脈內(nèi)膜依靠動(dòng)脈管腔內(nèi)彌散的氧供應(yīng)，動(dòng)脈外膜部分依靠動(dòng)脈的滋養(yǎng)血管(vasa vasorum，VV)滋養(yǎng)。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化形成時(shí)，動(dòng)脈的中-內(nèi)膜血管增厚，由于動(dòng)脈血管局部缺血誘發(fā)細(xì)胞因子釋放，作為誘因，誘導(dǎo)形成新生血管。由于周膜細(xì)胞的缺失，導(dǎo)致炎性基質(zhì)成分大量沉積，而沉積的炎性基質(zhì)成分又阻斷了腔內(nèi)的彌散氧，從而AS 斑塊逐漸增大，加速新生血管的形成。由于新生血管具有易破裂出血、誘發(fā)巨噬細(xì)胞浸潤和斑塊中央壞死等特點(diǎn)，因此被視為反映斑塊穩(wěn)定性的重要標(biāo)志。近年來，臨床評價(jià)AS斑塊內(nèi)的新生血管普遍使用的方法主要是對ROI 的時(shí)間-強(qiáng)度曲線進(jìn)行超聲造影定量分析［6］，采集量化參數(shù)表征目標(biāo)屬性，ROI 中各像素點(diǎn)的灰度均值或中值顯示造影增強(qiáng)強(qiáng)度。這種分析方法起初應(yīng)用于心、肝、腎等部位［7］，隨著應(yīng)用的發(fā)展，逐漸在斑塊的CEUS 定量分析使用［8-10］。此項(xiàng)研究將超聲造影定量分析與免疫組學(xué)檢測進(jìn)行對照研究。與半定量研究比較，定量分析提供的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)增強(qiáng)的量化指標(biāo)更具有客觀性［11-12］，研究者同時(shí)測量斑塊內(nèi)的EI 及斑塊內(nèi)的EI 與腹主動(dòng)脈管腔內(nèi)的EI 的比值(ratio)，加以比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果又采用斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的第八因子相關(guān)F8 抗原對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管增生程度進(jìn)一步反映。因此通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)項(xiàng)部電針對動(dòng)脈硬化斑塊形成的抑制。

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