綠原酸磷脂復(fù)合物固體分散體的體外溶出和藥動(dòng)學(xué)研究

趙安權(quán)　王倩倩　李佳　樊萌春　賀英菊

摘要：為研究綠原酸磷脂復(fù)合物固體分散體（CA-PC-SD）的體外溶出以及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)規(guī)律，采用HPLC法考察CA-PC-SD的體外溶出，大鼠灌胃后測(cè)定其血藥濃度，并采用DAS 2.0軟件分析計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示：CA-PC-SD顯著改善綠原酸磷脂復(fù)合物（CA-PC）的溶出效果，相較于原料藥（CA）其相對(duì)生物利用度提高2.12倍。表明CA-PC-SD能顯著改善CA-PC的體外溶出特性以及cA的口服生物利用率。

關(guān)鍵詞：綠原酸；磷脂復(fù)合物；固體分散體；溶出度；藥動(dòng)學(xué)；口服生物利用度

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2015）01-0054-04

0引言

綠原酸（chlorogenic acid，cA），是一種苯丙素類化合物，由咖啡酸（caffeic acid）和奎尼酸（quinic acid）縮合而成，又名咖啡鞣酸，在金銀花、野菊花、杜仲、蒲公英、向日葵等多種植物中均有發(fā)現(xiàn)。綠原酸生物活性十分廣泛，具有利膽、抗菌、抗病毒、穩(wěn)定血糖、增加白血球、止血、縮短血凝和出血時(shí)間以及增強(qiáng)免疫等多種藥用功能；但由于其脂溶性差、體內(nèi)消除半衰期短、代謝廣泛、口服生物利用度低，從而限制了臨床的應(yīng)用。研究表明，磷脂復(fù)合物能有效提高藥物的脂溶性，但由于磷脂復(fù)合物的溶出效果不佳，極大影響了口服生物利用度。本文將綠原酸磷脂復(fù)合物進(jìn)一步制成綠原酸磷脂復(fù)合物固體分散體，旨在改善磷脂復(fù)合物的溶出效果，并與原料藥cA和磷脂復(fù)合物（CA-PC）相比較，研究了大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程及生物利用度，為綠原酸口服新劑型的研制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；CPA225D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化設(shè)備有限公司）；85-2恒溫磁力攪拌器（常州普天儀器制造有限公司）；TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ZP-200振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；DW-F L270低溫冰箱（中科美菱）。綠原酸原料（自制）；綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201314，純度96.6%）；葛根素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110752-200912，純度96%）；大豆卵磷脂（德國(guó)Lipoid）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30，成都市科龍化工試劑廠）；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。雄性SD大鼠（四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重（210±20）g。

2方法與結(jié)果

2.1樣品的制備

由于課題組在前一階段已經(jīng)完成對(duì)綠原酸磷脂復(fù)合物（CA-PC）的最佳工藝研究，即在20℃下，以無水乙醇為反應(yīng)溶劑，綠原酸與磷脂最佳質(zhì)量比為1：1，反應(yīng)體系中綠原酸質(zhì)量濃度為7.5 mg/mL，磁力攪拌2 h。反應(yīng)完成后在體系中繼續(xù)加入一定量的PVP-K30，超聲5min使其溶解，轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60℃除去無水乙醇即得綠原酸磷脂復(fù)合物固體分散體（CA-PC-SD），粉碎，過篩，裝膠囊備用。

2.2 CA-PC-SD中CA的體外含量測(cè)定方法

1）色譜條件。采用Aichcrombood AQ C18色譜柱（250 minx4.6 minx5 μm），以乙腈-0.1%磷酸（20：80）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，柱溫40℃，流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL，測(cè)得結(jié)果如圖1所示，制劑中輔料不會(huì)干擾CA的測(cè)定，此色譜條件下CA與雜質(zhì)分離良好。

2）線性范圍的考察。取適量的綠原酸對(duì)照品，精密稱定，用甲醇溶解并配制儲(chǔ)備液。精密吸取適量?jī)?chǔ)備液，配制質(zhì)量濃度分別為3.90，7.80，9.75，15.60，19.50，23.40，31.20，39.00，58.50μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣并記錄峰面積。以樣品濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=717987X-54210（r=-0.9995），線性范圍為3.90～58.50μg/mL。

2.3 CA-PC-SD中CA體內(nèi)分析方法的建立

1）血漿樣品的處理。大鼠尾靜脈采集血樣0.3 mL，置于預(yù)先肝素化的0.5mL離心管中，振搖，8000r/min離心5 min，取上層血漿100μL于另一0.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)（含葛根素100μg/L）的甲醇溶液100μL以及100μL甲醇-0.2%磷酸溶液（20：80），渦旋振蕩2min，8000r/min離心5min，取上清液20μL進(jìn)樣。

2）色譜條件與專屬性考察。采用Aichcrombood-AQ C18色譜柱（250 mmx4.6 mmx5 μm），以乙腈-0.2%甲酸（15：85）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，柱溫40℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20μL。在此色譜條件下，測(cè)得空白血漿、空白血漿加CA對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)葛根素、大鼠血漿樣品加內(nèi)標(biāo)葛根素的色譜圖（見圖2）。由圖可見，CA的峰形良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾CA與內(nèi)標(biāo)的分離測(cè)定。

3）血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量的綠原酸對(duì)照品，精密稱定，用甲醇溶解并配制成儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液適量，用甲醇溶液稀釋，得質(zhì)量濃度分別為25.88，51.75，103.50，207.10，414.10，828.13，1 656.25 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)CA溶液各100μl，加入空白血漿100μl，混勻，配成含CA的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按2.3.1血漿樣品處理步驟和2.3.1方法進(jìn)樣，記錄峰面積。以CA與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（y）對(duì)血漿中CA的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=0.0002X+0.009 1（r²=0.9993），線性范圍為25.88～1 656.25 ng/mL。

4）精密度試驗(yàn)。取15支0.5 mL離心管，均分為3組，加入空白血漿100μL，加入質(zhì)量濃度分別為25.88，207.10，1656.25 ng/mL CA對(duì)照品溶液100μL，混勻，配成含CA的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，于1d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次及連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。其日內(nèi)精密度RSD分別為4.85%、3.93%、2.73%，日間精密度RSD分別為5.04%、4.83%、3.95%，結(jié)果說明此方法的精密度良好，符合生物樣品的測(cè)定要求。

5）回收率實(shí)驗(yàn)。取15支0.5mL離心管，均分為3組，加入空白血漿100μL，分別加入低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的綠原酸對(duì)照品溶液100μL，混勻，配成含CA的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按照所建立的方法進(jìn)行處理及測(cè)定，測(cè)得低、中、高質(zhì)量濃度分別為25.88，207.10，1656.25ng/mL的含CA樣品的回收率分別為100.8%、99.7%、101.4%。

6）樣品穩(wěn)定性考察。取空白血漿100μL，制備質(zhì)量濃度分別為25.88，207.10，1 656.25 ng/mL的含藥血漿樣品（n=5），按2.3.1方法處理后，室溫放置0，10，24 h后再測(cè)定，記錄樣品峰面積，計(jì)算實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，并與0時(shí)刻測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明低、中、高3種質(zhì)量濃度的樣品放置0，10，24 h后，RSD均≤5.0%。

2.4體外溶出試驗(yàn)

取CA-PC及含不同量PVP-K30的固體分散體（CA-PC-SD），碾碎，研磨裝膠囊，采用中國(guó)藥典規(guī)定的小杯法，于200mL水中，溫度（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，CA-PC分別于10，30，60，90，120，180min，而CA-PC-SD分別于5，10，20，30，45，60，90min取樣5mL，并同時(shí)補(bǔ)充同溫等量新鮮介質(zhì)，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液1mL稀釋后，照含量測(cè)定2.2.1方法進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定綠原酸質(zhì)量濃度，計(jì)算累積釋藥百分率，結(jié)果見圖3。

從圖中不難看出CA與PVP-K30以1：3、1：5、1：7的比例形成CA-PC-SD時(shí)均能夠顯著提高溶出效果，相較于CA-PC，在溶出速率和溶出百分比上優(yōu)勢(shì)明顯，而從最終產(chǎn)物的聚集狀態(tài)、反應(yīng)時(shí)間和成本等因素考慮，優(yōu)選1：5時(shí)為最佳處方進(jìn)行生物利用度的考察。

2.5大鼠體內(nèi)生物利用度實(shí)驗(yàn)

將15只SD雄鼠隨機(jī)分成3組，正常飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，只給飲水，分別灌胃給予200mg/kg的原料藥CA和相應(yīng)劑量的CA-PC以及CA與PVPK30之比為1：5的CA-PC-SD。原料藥CA組分別于3，10，17，25，35，60，90，180，240，300，360，480 min斷尾靜脈取血，其余組分別于8，15，30，45，60，90，120，150，240，360，480，500min斷尾靜脈取血，然后迅速裝入肝素化的0.5mL離心管中，振搖，8000r/min離心5min，分離血漿，于-40℃冰箱儲(chǔ)存。取血漿100μL按2.3.1方法處理后，按2.3.2下條件進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)則定結(jié)果繪制CA的平均血藥濃度一時(shí)間曲線，如圖4所示。

采用藥動(dòng)學(xué)DAS 2.0軟件分析計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，根據(jù)二室模型依賴性參數(shù)估算方法，求得兩者的藥動(dòng)學(xué)主要參數(shù)，結(jié)果見表1。

由表中的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可以看出：CA-PC-SD較原料藥CA和CA-PC而言，AUC_0-t、AUC_0-∞均明顯增大，表明前者的吸收比后二者顯著改善。CA-PC-SD的平均達(dá)峰時(shí)間T_max以及MRT_0-t也較原料藥CA延長(zhǎng)，可見其在體內(nèi)的吸收時(shí)間延長(zhǎng)，平均滯留時(shí)間增加。從C_max可以看出，CA制成磷脂復(fù)合物固體分散體后，F(xiàn)=（AUC_CA-PC-SDAUC_CA）×100%=（3 095.0/1 548.4）×100%=212.2%，結(jié)果表明CA制成磷脂復(fù)合物固體分散體后，口服生物利用度提高2.12倍。

3討論

CA屬于生物藥劑學(xué)中第3類藥物，水溶性好，脂溶性差，因此口服生物利用率低。實(shí)驗(yàn)從改善其口服生物利用率入手，旨在以磷脂復(fù)合物這一劑型為載體改善其脂溶性，從而間接提高跨膜能力，促進(jìn)口服吸收。但課題組前一階段的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然磷脂復(fù)合物確實(shí)積極的改觀了CA的脂溶性，但是由于CA-PC的溶出效果太差，直接影響了生物利用度的提高。所以，作者將磷脂復(fù)合物進(jìn)一步開發(fā)為固體分散體，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，固體分散體的溶出速率和累積溶出百分比都大大優(yōu)于磷脂復(fù)合物組，這對(duì)固體制劑口服生物利用度的影響必然是有益的。實(shí)驗(yàn)中選擇CA與PVP K30的比例為1：5的固體分散體與原料藥CA和CA-PC相比較，進(jìn)行大鼠藥動(dòng)學(xué)的試驗(yàn)，得到了更為確切的結(jié)論：CA-PC-SD的AUC。AUC_0-∞、C_max均遠(yuǎn)高于CA和CA-PC組，這也充分說明溶出效果的改良能促進(jìn)口服生物利用度的提高，表現(xiàn)出了良好的體內(nèi)外相關(guān)性。

從大鼠藥動(dòng)學(xué)的結(jié)果分析CA-PC組的吸收效果提高并不明顯，但表現(xiàn)出了一定的緩釋能力，這可能與其釋藥行為有關(guān)。

4結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)將CA制備成CA-PC-SD，有效改善了其口服吸收，并建立了CA的體內(nèi)外檢測(cè)方法，為其體內(nèi)外檢測(cè)提供了理論依據(jù)，對(duì)CA的體外溶出的研究和體內(nèi)生物利用度的考察，為CA口服新劑型的研制提供了參考。