食源性致病菌檢測(cè)新方法

楊興國(guó)

近年來(lái)食品安全得到了世界各國(guó)的普遍關(guān)注。每年向衛(wèi)生部上報(bào)的食物中毒人數(shù)逐年遞增，且大部分是由食源性致病菌所引起。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物引起的。由此可見(jiàn)，食源性疾病與食品污染問(wèn)題已成為世界范圍內(nèi)舉足輕重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。同時(shí)，GB 29921-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》于2014年7月1日實(shí)施，對(duì)食品中致病菌的規(guī)定更加嚴(yán)格。所以建立有效的食源性致病菌檢測(cè)體系，快速并且準(zhǔn)確地完成對(duì)食品中致病菌的檢測(cè)已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，除了傳統(tǒng)檢測(cè)方法外，在食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域出現(xiàn)了許多比傳統(tǒng)方法更快捷、敏感性更好的新技術(shù)，如免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)等。本文對(duì)目前國(guó)內(nèi)外食源性致病菌的檢測(cè)方法進(jìn)行歸納和綜述，并對(duì)不同方法進(jìn)行闡述和分析。

免疫學(xué)方法

檢測(cè)食品中致病菌的免疫學(xué)方法主要有免疫擴(kuò)散法、反向間接凝血試驗(yàn)（即HA）、反向被動(dòng)乳膠凝集試驗(yàn)（RPLA）、放射免疫法（RIA）、免疫熒光技術(shù)（IFT）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

最初應(yīng)用的免疫學(xué)方法為免疫擴(kuò)散法，它主要分為單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，但這兩種方法的檢出靈敏度較低，檢測(cè)的食品標(biāo)本需要濃縮，操作量大、工作繁瑣，因而未能推廣。RIA的應(yīng)用將同位素測(cè)定的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性有效地結(jié)合在一起，使得其檢測(cè)的靈敏度和特異性均有所提高而且具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。RIA測(cè)定食品標(biāo)本不需要濃縮，1～2d內(nèi)可出結(jié)果，檢測(cè)各種食品中的金黃色葡萄球菌的靈敏度為1～10ng/g，但該方法存在放射性污染和需要專門的防護(hù)設(shè)備、檢測(cè)儀器等問(wèn)題，也不易推廣。

免疫熒光技術(shù)（IFT）是在將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性的熒光反應(yīng)，可用來(lái)對(duì)葡萄球菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌和單核增生李斯特氏菌等進(jìn)行快速檢測(cè)。此方法的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。但存在一些不足尚未完全解決，如非特異性染色問(wèn)題，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序比較復(fù)雜。

ELISA方法是一種敏感、快速、簡(jiǎn)單的方法，應(yīng)用較廣。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的基本原理是將抗原或抗體預(yù)先吸附于固相載體表面，再加入受檢樣品和酶標(biāo)抗體，進(jìn)行免疫酶染色，最后經(jīng)固相載體上的酶催化產(chǎn)生顏色變化，從而判斷受檢樣品是否含有目的抗原。同時(shí)通過(guò)分析有色產(chǎn)物量可以確定樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對(duì)不同的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ELISA法對(duì)多種食源性致病菌的靈敏度和特異性較好。但ELISA對(duì)試劑的選擇性高，很難同時(shí)分析多種成分，且對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有交叉反應(yīng)。

基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)末誕生的一項(xiàng)新型生物技術(shù)。它是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過(guò)掃描儀定量和分析熒光分布模式來(lái)確定檢測(cè)樣品是否存在某些特異微生物。其檢測(cè)致病菌原理為：選擇細(xì)菌的共有基因作為靶基因，用一對(duì)通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，再利用芯片上的探針檢測(cè)不同細(xì)菌在該共有基因上的獨(dú)特堿基，從而區(qū)分不同的細(xì)菌，此法還可以通過(guò)向寡核苷酸探針陣列中添加相應(yīng)的探針來(lái)逐步擴(kuò)大基因芯片的檢測(cè)范圍，并通過(guò)增加和調(diào)整探針來(lái)逐步提高基因芯片的準(zhǔn)確性?；蛐酒夹g(shù)理論上可以在一次實(shí)驗(yàn)中檢出所有潛在的致病菌，也可以用同一張芯片檢測(cè)某一致病原的各種遺傳學(xué)指標(biāo)，檢測(cè)的靈敏度、特異性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析檢測(cè)中有很好的發(fā)展前景。

核酸探針技術(shù)

核酸探針檢測(cè)技術(shù)的依據(jù)是核酸雜交，其工作原理是兩條堿基互補(bǔ)的DNA鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下可以按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，形成雜交DNA分子。已知每個(gè)生物的各種性質(zhì)和特征都是由其所含的遺傳基因所決定，因此，從理論上講，任何一個(gè)決定生物體特定生物學(xué)特征的DNA序列都應(yīng)該是獨(dú)特的。通過(guò)將微生物的特征基因的一條DNA鏈進(jìn)行標(biāo)記，即可制成DNA探針。標(biāo)記的方法可分為兩種：放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。放射性探針是以同位素為標(biāo)記物，常用的同位素包括32P、3H、35S，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)分析結(jié)果；非放射性探針是以生物素、酶和熒光素等為標(biāo)記物，雜交后通過(guò)酶催化底物顯色反應(yīng)、熒光顯微鏡或熒光儀檢測(cè)雜交結(jié)果。用大腸桿菌編碼葡萄糖醛酸酶的uidA基因設(shè)計(jì)探針，用以檢測(cè)食品中的總大腸桿菌。

光學(xué)生物傳感技術(shù)

光學(xué)生物傳感器源于傳統(tǒng)的物理傳感器，它將反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為光信號(hào)，其最大的優(yōu)點(diǎn)是抗外界干擾能力強(qiáng)。光學(xué)生物傳感器的檢測(cè)模式有吸收、反射、化學(xué)發(fā)光、熒光和磷光等，在致病菌檢測(cè)中最有應(yīng)用前景的技術(shù)包括表面等離子共振技術(shù)等。表面等離子共振技術(shù)是一種基于反射光譜的非標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。它將已知生物分子固化在幾十納米厚的金屬膜表面，加入能夠與之結(jié)合的目標(biāo)生物分子，由此引發(fā)的光學(xué)信號(hào)隨機(jī)被表面等離子共振傳感器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是在體外合適條件下，以DNA為模板，以一對(duì)人工合成的寡核苷酸為引物在耐熱DNA聚合酶作用下特異性擴(kuò)增目的DNA片段的技術(shù)。近年來(lái)應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌的技術(shù)有很多，如常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、不對(duì)稱PCR、免疫PCR、套式PCR和電化學(xué)發(fā)光PCR等。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種DNA擴(kuò)增技術(shù)。多重PCR在同一反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對(duì)引物，擴(kuò)增多條目的DNA片段，所以可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)菌。相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，多重PCR檢測(cè)技術(shù)可以極大地縮短檢測(cè)時(shí)間，且操作簡(jiǎn)單、特異性和敏感度較高。因此采用多重PCR方法檢測(cè)多種細(xì)菌一直是細(xì)菌快速檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。但是多重PCR技術(shù)在實(shí)際的檢驗(yàn)工作中還存在一些問(wèn)題：如提取得到的DNA片段可能不完整，多組引物之間的相互干擾，高濃度模板對(duì)低濃度模板產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制以及樣品中可能含有PCR抑制物質(zhì)等。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出。實(shí)時(shí)熒光PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光分子，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)實(shí)時(shí)反應(yīng)模板的擴(kuò)增量，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)采用全密閉管檢測(cè)，不僅實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA模板定量，還能避免電泳帶來(lái)的誤差和污染，具有重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高、實(shí)時(shí)性強(qiáng)和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR類型主要有探針類和非探針類兩種。探針類是利用與靶序列特異雜交探針指示擴(kuò)增產(chǎn)物增加，特異性好；而非探針類是利用染料或特殊設(shè)計(jì)引物指示擴(kuò)增產(chǎn)物增加，特異性不強(qiáng)，但簡(jiǎn)便易行。目前在國(guó)內(nèi)外實(shí)時(shí)熒光定量PCR廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域。

食品安全問(wèn)題關(guān)系到國(guó)計(jì)民生，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展，必然會(huì)對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)提出越來(lái)越多的要求。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、分離、鑒定與檢測(cè)的技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)且檢出敏感性差。但使用傳統(tǒng)檢測(cè)方法可獲得供后續(xù)研究的致病菌菌落，所以該方法仍是食源性致病菌檢測(cè)的最基本檢驗(yàn)方法。

對(duì)于食品中的致病菌檢測(cè)來(lái)說(shuō)，依靠單一的手段已不能滿足現(xiàn)階段的檢測(cè)要求。多種技術(shù)的聯(lián)用可大大提高檢測(cè)的靈敏度，并減少檢測(cè)時(shí)間。隨著微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，各種多功能微生物檢測(cè)系統(tǒng)的研發(fā)逐步成為熱點(diǎn)。3M分子檢測(cè)系統(tǒng)就將環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）和生物熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)（BART）結(jié)合在一起，可實(shí)現(xiàn)在分子層面上對(duì)食源性致病菌準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)。隨著人們對(duì)食品微生物認(rèn)識(shí)的逐步深入，相信會(huì)有越來(lái)越多的食源性致病菌分析方法和檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到實(shí)際生活中。