二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達(dá)影響的研究

李賓,張卉,張輝

(1.河南黃淮學(xué)院 生物工程系，河南 駐馬店 463000；2.河南黃淮學(xué)院 護(hù)理學(xué)系，河南 駐馬店 463000；3.駐馬店市中心醫(yī)院 泌尿外科，河南 駐馬店 463000)

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二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達(dá)影響的研究

李賓1,張卉2,張輝3

(1.河南黃淮學(xué)院 生物工程系，河南 駐馬店 463000；2.河南黃淮學(xué)院 護(hù)理學(xué)系，河南 駐馬店 463000；3.駐馬店市中心醫(yī)院 泌尿外科，河南 駐馬店 463000)

目的 分析趨化因子CXCL1及受體CXCR2在小鼠骨癌痛模型中的作用，并探討二磷酸鹽對(duì)小鼠骨癌痛模型的干預(yù)機(jī)制。方法 60只小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、模型組和治療組。股骨遠(yuǎn)端骨髓腔注射N(xiāo)CTC2742細(xì)胞復(fù)制小鼠股骨痛模型，治療組給予二磷酸鹽治療，對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水。Real-time PCR分析各組中趨化因子CXCL1和CXCR2mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)CXCL1、CXCR2蛋白及腫瘤壞死因子TNF-α以及細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl2以及Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 模型組小鼠的機(jī)械縮爪閾值較對(duì)照組有顯著的增高(P<0.05，P<0.01)，而藥物治療組對(duì)模型組小鼠的升高的閾值有顯著的改善作用(P<0.01)；與對(duì)照組比較，骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，二磷酸鹽可以顯著抑制CXCL1及CXCR2的表達(dá)(P<0.01)；與對(duì)照組比較，骨癌痛模型小鼠腫瘤壞死因子TNF-α、促細(xì)胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表達(dá)明顯增高，凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而二磷酸鹽可以顯著改善上述指標(biāo)表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 二磷酸鹽通過(guò)下調(diào)骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療骨癌痛模型小鼠的作用。

二磷酸鹽；骨癌痛；趨化因子；細(xì)胞凋亡；受體

骨癌是發(fā)生于骨骼及其附屬組織的惡性腫瘤，臨床上進(jìn)展迅速、預(yù)后不佳、死亡率高[1-3]。骨癌臨床上表現(xiàn)為功能障礙、腫脹或腫塊以及壓迫癥狀，但其早期出現(xiàn)的主要癥狀為疼痛[4-5]。但是，目前對(duì)骨癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。臨床上治療骨癌主要采用手術(shù)切除、化療及放療方法。本研究采用股骨遠(yuǎn)端骨髓腔注射N(xiāo)CTC2742細(xì)胞復(fù)制小鼠股骨痛模型，分析趨化因子CXCL1及受體CXCR2在小鼠骨癌痛模型中的參與作用，并探討二磷酸鹽對(duì)小鼠骨癌通模型的干預(yù)機(jī)制。同時(shí)研究也分析了TNF-α及細(xì)胞凋亡的參與機(jī)制，以期為臨床相關(guān)治療機(jī)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)SZXK(上)20080033]，體質(zhì)量22～25 g。小鼠于(22±2)℃、濕度(50±5)%適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水。60只小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、模型組和治療組(n=20)。所有操作均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2 儀器與試劑 mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：大連寶生物工程有限公司；SYBR Premix Ex Taq：大連寶生物工程有限公司；熒光定量PCR儀：ABI7700，美國(guó)ABI公司；引物合成：上海生工生物有限公司；脫脂奶粉：內(nèi)蒙古伊利乳業(yè)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠/羊抗兔的二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司和Abcam公司(詳見(jiàn)1.5)； PVDF膜：美國(guó)Amersham公司；電泳槽、電泳儀及蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)：美國(guó)ABI公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)20130906)；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.3 骨癌通模型復(fù)制 骨癌通模型復(fù)制參照馬正良等[6]報(bào)道的方法：小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后行右膝關(guān)節(jié)切開(kāi)術(shù)，并將NCTC細(xì)胞(約2×105個(gè))注入股骨遠(yuǎn)端骨髓腔中，然后將傷口用手術(shù)線縫合后于適宜環(huán)境下飼養(yǎng)。對(duì)照組僅接種MEM培養(yǎng)基。按照文獻(xiàn)[6]的方法分析各組動(dòng)物的機(jī)械縮爪閾值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各組小鼠右側(cè)股骨標(biāo)本于液氮中保存。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)趨化因子CXCL1和CXCR2 mRNA的表達(dá) mRNA的提取及純化按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Real-time PCR的擴(kuò)增體系：2×qPCR Mix 5 μL，上游和下游引物各10 pmol，模板cDNA 2 μL，dH2O 1 μL，共10 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃10 s，60 ℃40 s，共28個(gè)循環(huán)。采用熔解曲線鑒定qRT-PCR產(chǎn)物，并用公式(ΔCt)進(jìn)行定量分析。ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。引物由大連寶生物合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for Real-time PCR

1.5 Western blot檢測(cè)CXCL1、CXCR2、TNF-α、Bax/Bcl2及Caspase-3蛋白表達(dá) 各組動(dòng)物股骨標(biāo)本組織充分勻漿，總蛋白提取嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作(蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)?？捡R斯亮藍(lán)法蛋白定量后以等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和半干法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后5%脫脂牛奶封閉2h。然后與一抗[CXCL1一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(工作濃度1:300)；CXCR2蛋白一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司(工作濃度1:500)；TNF-α(工作濃度1:400)、Bax(工作濃度1:500)/Bcl2(工作濃度1:200)及Caspase-3(工作濃度1:300)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司]溫孵過(guò)夜，PBS漂洗3次后與HRP標(biāo)記二抗(1:200)室溫反應(yīng)1 h漂洗后ECL混合液顯色、曝光、顯影、定影，用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度，以β-actin作為參照，進(jìn)行蛋白表達(dá)的定量分析。

2 結(jié)果

2.1 二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠機(jī)械縮爪闕值影響的分析 本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的機(jī)械縮爪閾值較對(duì)照組有顯著的增高(P<0.05，P<0.01)，而藥物治療組對(duì)模型組小鼠的升高的閾值有顯著的改善作用(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠機(jī)械縮爪闕值影響的分析#P<0.05，##P<0.01，與對(duì)照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig．1 The effect of diphosphate on cancer pain threshold in bone pain model and drug interventions#P<0.05，##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

2.2 二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠CXCL1表達(dá)的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1的表達(dá)明顯增高(P<0.01)，而二磷酸鹽可以顯著抑制上調(diào)的CXCL1的表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠CXCL1表達(dá)的影響的分析##P<0.01，與對(duì)照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig.2 The increased expression of CXCL1 in bone pain model and drug interventions##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

2.3 二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠 CXCR2受體表達(dá)的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCR2的表達(dá)明顯增高(P<0.01)，且與對(duì)照組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，而二磷酸鹽可以顯著抑制上調(diào)的CXCR2的表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠CXCR2表達(dá)的影響的分析##P<0.01，與對(duì)照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig.3 The increased expression of CXCR2 in bone pain model and drug interventions##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

2.4 TNF-α表達(dá)分析及二磷酸鹽干預(yù)作用 本研究發(fā)現(xiàn)，骨癌痛模型小鼠腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)明顯增高(P<0.01)，且與對(duì)照組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，而二磷酸鹽可以顯著抑制上調(diào)的TNF-α的表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠TNF-α表達(dá)的影響的分析##P<0.01，與對(duì)照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig.4 The increased expression of TNF-α in bone pain model and drug interventions##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

2.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及藥物干預(yù)作用 本研究發(fā)現(xiàn)，骨癌痛模型小鼠促細(xì)胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表達(dá)明顯增高，而抑制凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，且與對(duì)照組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，而二磷酸鹽可以顯著改善上述蛋白的異常表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖5 二磷酸鹽對(duì)骨癌痛模型小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響的分析##P<0.01，與對(duì)照組相比；**P<0.01，與模型組相比Fig.5 The increased expression of Bax and Caspase-3 as well as decreased expression of Bcl2 in bone pain model and drug interventions##P<0.01，compared with control group；**P<0.01，compared with model group

3 討論

骨癌是臨床上常見(jiàn)的腫瘤之一，進(jìn)展迅速，其發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢(shì)。骨癌有原發(fā)性骨癌和繼發(fā)性骨癌。如臨床上前列腺癌患者容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，骨癌模型通常采用跟骨、脛骨等建立模型，股骨由于骨髓腔較大，容易操作[7-9]，因此本研究采用股骨建立骨癌模型，分析趨化因子CXCL1及受體CXCR2在小鼠骨癌痛模型中的參與作用。研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠CXCL1及受體CXCR2表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)TNF-α以及促細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)下調(diào)，而抑制凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)上調(diào)。二磷酸鹽治療組上述蛋白的異常表達(dá)得到部分恢復(fù)。因此，二磷酸鹽通過(guò)下調(diào)骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療骨癌痛模型小鼠的作用。

骨癌痛是臨床上骨癌早期最主要的癥狀之一，早期癥狀較輕，而隨著病情的加重疼痛度逐漸增加。骨癌痛發(fā)展多為持續(xù)性發(fā)病，在夜間疼痛容易加劇。已有的研究證實(shí)，趨化因子及其受體在疼痛的發(fā)生及加劇過(guò)程中有廣泛的參與性，如CCL2/CCR2、CXCL1/CXCR2、CX3CL1/CR1[10-11]。研究證實(shí)，骨癌痛患者CCL2與脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化密切相關(guān)，且參與了骨癌痛的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[12]。在研究大鼠足底炎性疼痛的研究中也證實(shí)，趨化因子IP-10參與完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的足底炎癥疼痛，而且JNK激酶能夠調(diào)控佐劑誘導(dǎo)的疼痛和IP-10的表達(dá)[13]。以往研究也證實(shí)，炎性疼痛中模型中單核細(xì)胞趨化因子及其受體信號(hào)通路通過(guò)增強(qiáng)模型中外周DRG痛覺(jué)神經(jīng)元的興奮性發(fā)揮 調(diào)節(jié)疼痛病理過(guò)程的作用[14]。同時(shí)，姜黃素通過(guò)下調(diào)大鼠脊髓背角和背根節(jié)CXCR1的表達(dá)緩解神經(jīng)病理性疼痛[15]。本研究中也證實(shí)，小鼠骨癌痛模型組中趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達(dá)明顯增強(qiáng)，而二磷酸鹽可以顯著下調(diào)其表達(dá)，提示其可能是通過(guò)抑制趨化因子的上調(diào)表達(dá)緩解NCTC細(xì)胞誘導(dǎo)的骨癌痛。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序化死亡過(guò)程，廣泛參與了多種病理過(guò)程的發(fā)展及發(fā)展，是由多種促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白所調(diào)節(jié)的。研究證實(shí)，蛇毒復(fù)方制劑能夠顯著下調(diào)W256細(xì)胞誘導(dǎo)的骨癌痛大鼠組織破骨細(xì)胞數(shù)量，并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡過(guò)程，上調(diào)骨組織中骨保保護(hù)素的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的保護(hù)作用[16]。同時(shí)，在骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)研究中也發(fā)現(xiàn)，Caspase-3基本的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而不依賴(lài)于外源或上游信號(hào)刺激，進(jìn)而緩解骨癌痛的發(fā)展[17]。本研究中也證實(shí)，腫瘤壞死因子TNF-α以及細(xì)胞凋亡蛋白Bax以及Caspase-3的表達(dá)在模型組明顯下調(diào)，而抑制凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)卻明顯下調(diào)，而二磷酸鹽可以顯著改善細(xì)胞凋亡蛋白的異常表達(dá)，表明細(xì)胞凋亡過(guò)程參與了NCTC細(xì)胞誘導(dǎo)的骨癌痛過(guò)程，二磷酸鹽主要通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)組織中細(xì)胞凋亡過(guò)程的發(fā)生而發(fā)揮緩解骨癌痛模型小鼠的作用。

因此，二磷酸鹽通過(guò)下調(diào)骨癌痛模型小鼠趨化因子CXCL1及受體CXCR2表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療骨癌痛模型小鼠的作用。

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(編校：王儼儼)

Effect of diphosphate on expression of CXCL1 and its receptor CXCR2 in bone cancer pain mice

LI Bin1,ZHANG Hui2,ZHANG Hui3

(1.College of Biological Engineering, Huanghuai University, Zhumadian 463000; 2.The Henan huanghuai College Nursing Department of Zhumadian 463000; 3.Department of Urinary Surgery, Zhumadian City Center Hospital, Zhumadian 463000)

ObjectiveTo explore the involvement of CXCL1 and CXCR2 in the pathogenesis of bone cancer pain and the interventions of diphophated.Methods60 mice were divided into 3 groups randomly: control, model and diphosphated group.The bone cancer pain mice were duplicated by injection of NCTC742 cell while control mice were received same dose of NS.Diphosphate group mice were received diphosphate while control group were received same dose of NS.The expressions of CXCL1, CXCR2, TNF-α and apoptosis proteins were detected by Real-time PCR and Western blot.ResultsThe cancer pain threshold in bone pain model were higher than that of control group (P<0.05,P<0.01), while cancer pain threshold in diphosphated group was improved(P<0.01).Compared with control group, the expression of chemotactic factor CXCL1 and its receptor of CXCR2 in model group were up-regulated(P<0.01), while the expression of those parameters were improved(P<0.01).The expression of TNF-α, Bax as well as Caspase-3 were up-regulated and Bcl2 was down-regulated in model group(P<0.01), while diphosphate normalized those parameters with a statistical difference(P<0.01). ConclusionDiphosphate alleviates the bone cancer pain by inhibiting the enhanced CXCL1 and its receptor CXCR2 as well as promoting apoptosis.

diphosphate; bone cancer pain; chemotactic factor; apoptosis; receptor

黃淮學(xué)院青年骨干教師資助計(jì)劃，河南省教育廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(14B180006)

李賓，男，碩士，講師，研究方向：分子生物學(xué)、生物化學(xué)，E-mail：binlyyy@163.com。

R927.1

A

1005-1678(2015)02-0031-04