乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平與紫杉醇抗腫瘤作用的關(guān)系研究

張肖冰，李慧，王鳳山，師以康

(山東大學(xué) 藥學(xué)院/國家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

?

乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平與紫杉醇抗腫瘤作用的關(guān)系研究

張肖冰，李慧，王鳳山，師以康Δ

(山東大學(xué) 藥學(xué)院/國家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

目的 研究紫杉醇對乳腺瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平的影響及其機(jī)制，探討蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平變化對紫杉醇抗腫瘤活性的影響。方法 使用Western blot檢測紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平及多種相關(guān)酶蛋白表達(dá)水平的影響；RT-qPCR檢測紫杉醇對N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase, OGA)和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(β-N-acetylglucosaminyltrans-fevase,OGT)mRNA水平的影響；采用OGA/OGT抑制劑PUGNAc/alloxan改變蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平，磺基羅丹明B法測定紫杉醇對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 紫杉醇可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高(P<0.05)，且具有時間和濃度依賴性；紫杉醇還可同時誘導(dǎo)OGA和OGT mRNA和蛋白水平的升高(P<0.05)，且具有濃度依賴性；采用OGA的抑制劑PUGNAc提高蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平后，細(xì)胞對紫杉醇的敏感性升高；采用OGT的抑制劑alloxan降低蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平后，細(xì)胞對紫杉醇的敏感性降低。結(jié)論 紫杉醇可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高，蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平的改變也會影響乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的藥物敏感性。

O-GlcNAc糖基化；紫杉醇；N-乙酰氨基葡萄糖苷酶；N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶

糖基化的蛋白質(zhì)按照糖與氨基酸的連接方式主要分為以下幾種：N-糖基化、O-糖基化、GPI錨定連接、糖胺聚糖以及 O-GlcNAc 糖基化。O-GlcNAc糖基化蛋白質(zhì)分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，其他幾個種類的糖基化蛋白質(zhì)主要分布于細(xì)胞膜上。O-GlcNAc糖基化修飾是指單個的N-乙酰氨基葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)以O(shè)-糖苷鍵連接在蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸的羥基氧原子上。蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化生物過程是由N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase，OGA)和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(β-N-acetylglucosaminyltransferase，OGT)共同調(diào)控來完成的。蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化廣泛參與細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯及加工、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等多種生命活動[1]。腫瘤組織中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平顯著升高，O-GlcNAc糖基化水平和腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。然而，細(xì)胞毒類藥物對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平是否產(chǎn)生影響及改變蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平是否影響腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性等，國內(nèi)外尚未見報道。本研究旨在通過闡述O-GlcNAc糖基化和紫杉醇的相互作用，以期為提高紫杉醇的抗腫瘤活性提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real time PCR Master Mix(SYBR Green)購自上海東洋紡(TOYOBO)生物科技有限公司。Trizol購自Invitrogen公司。GADPH、OGA和OGT的引物均由上海Invitrogen公司合成。O-GlcNAc糖基化蛋白抗體CTD110.6、OGA抗體、OGT抗體、HRP標(biāo)記的抗雞IgY抗體、HRP標(biāo)記的抗小鼠IgM、OGT抑制劑alloxan、OGA抑制劑PUGNAc均購自美國Sigma公司。己糖激酶(HK2)抗體和丙酮酸激酶(PKM2)抗體均購自CST。谷氨酰胺6-磷酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶1(GFAT1)抗體、6-磷酸果糖激酶1(PFK1)抗體、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT1)抗體和actin抗體購自Santa Cruz公司。HRP標(biāo)記的抗兔IgG購自北京中杉金橋生物有限公司。蛋白Marker購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：MDA-MB-231細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)并傳代。

1.2.2 Western blot法檢測不同濃度紫杉醇和不同處理時間對細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾水平及其合成相關(guān)酶表達(dá)：取對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，以4×105個/皿接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后，分別加入濃度為0.1、1、10 μM的紫杉醇，每組共設(shè)3個平行孔，以完全培養(yǎng)基(0 μM紫杉醇)為空白對照，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白；或者均加入1 μM的紫杉醇，分別于加藥后3、6、12、24、48、72 h提取細(xì)胞總蛋白(以0 h為空白對照)。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓180 V電轉(zhuǎn)100 min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入各指標(biāo)相應(yīng)的抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色。采用同樣的方法測定添加不同濃度OGA抑制劑PUGNAc(10、50、100 μM)或者OGT抑制劑alloxan(1、5、10 mM)對乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平的影響。Western blot測定的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化是樣品中所有O-GlcNAc糖蛋白的總體水平，其灰度值代表所有糖基化蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾的總體程度。蛋白條帶的灰度值使用Alph Ease FC軟件進(jìn)行處理獲得。

1.2.3 RT-qPCR法檢測細(xì)胞OGA和OGT的mRNA水平：取對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，以1×105個/皿接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為0.1、1、10 μM的紫杉醇，每組共設(shè)3個平行孔，以完全培養(yǎng)基(0 μM紫杉醇)為空白對照。于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，通過Trizol法提取每組細(xì)胞的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real time PCR Master Mix(SYBR Green)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。OGA、OGT及GADPH基因的引物分別如下：OGA上游引物：5′-GAAGGAGAGTCAAG-CGACGTT-3′，OGA下游引物：5′-TCCATAACCCAAGGTCTTCCAT-3′；OGT上游引物：5′-TCCTGATTTGGTACTGTGTTCGC-3′，OGT下游引物：5′-AAGC-TACTGCAAAGTTCGGTT-3′；GADPH上游引物：5′-GGAG-CGAGATCCCTCCAAAAT-3′，GADPH下游引物：5′-GGCTGTTGT-CATACTTCTCATGG-3′。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃，30 s；PCR循環(huán)(×40循環(huán))：95 ℃，5 s；57 ℃，10 s；72 ℃，15 s。

1.2.4 磺基羅丹明B(SRB)法檢測紫杉醇對細(xì)胞的增殖抑制作用：取對數(shù)期生長的乳腺癌細(xì)胞,以2000個/孔接種到96孔板中，每孔中加入200 μL細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的紫杉醇(0.1、1.0、10 μM)處理，每組共設(shè)3個平行孔，以完全培養(yǎng)基(0 μM紫杉醇)為空白對照，加藥處理48 h后，用三氯乙酸固定、0.4%SRB溶液、100mM Tris(pH 10.5)處理，酶標(biāo)儀檢測OD540值，計算細(xì)胞存活率。采用同樣方法測定添加不同濃度OGA抑制劑PUGNAc(10、50、100 μM)或OGT抑制劑alloxan(1、5、10 mM)對腫瘤細(xì)胞增殖抑制的影響。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平及其合成相關(guān)酶表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示，紫杉醇誘導(dǎo)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高，并具有濃度依賴性(P<0.01)；OGA和OGT的表達(dá)隨紫杉醇濃度升高明顯升高(P<0.01)；HK2和GFAT1表達(dá)也明顯升高(P<0.01)；PFK1、PKM2和GLUT1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。使用1.0 μM的紫杉醇處理MDA-MB-231細(xì)胞不同時間，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平不斷升高(P<0.05，P<0.01)，具有時間依賴性。紫杉醇誘導(dǎo)72 h后OGA和OGT仍處于最高表達(dá)水平(P<0.01)；HK2和GFAT1表達(dá)隨時間明顯升高(P<0.01)，PFK1、PKM2和GLUT1的蛋白表達(dá)水平隨時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

圖1 不同濃度紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化及其合成相關(guān)酶表達(dá)水平的影響(n=3)*P<0.01，與0 μM Taxol處理組比較Fig.1 Effects of different Taxol concentrations on the expressions of protein O-GlcNAcylation and enzymes related to its biosysthesis in breast cancer cell MDA-MB-231(n=3)*P<0.01, compared with 0 μM Taxol treatment group

圖2 紫杉醇處理不同時間對MDA-MB-231細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化及其合成相關(guān)酶表達(dá)水平的影響(n=3)*P<0.05，**P<0.01，與0 h處理組比較Fig.2 The time-course effect of Taxol on the expressions of protein O-GlcNAcylation and enzymes related to its biosysthesis in breast cancer cell MDA-MB-231(n=3)*P<0.05,**P<0.01,compared with 0h Taxol treatment group

2.2 不同濃度紫杉醇對OGA和OGT mRNA水平的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，不同濃度紫杉醇處理MDA-MB-231細(xì)胞 24 h 后，OGA和OGT的mRNA水平均逐漸升高，具有濃度依賴性；且OGA mRNA升高的程度明顯高于OGT(P<0.05)，見圖3。

圖3 不同濃度紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞OGA和OGT mRNA水平的影響(n=3)*P<0.05,與同組OGT比較Fig.3 Effects of Taxol on OGT and OGA mRNA levels in breast cancer cell MDA-MB-231(n=3)*P<0.05,compared with OGT

2.3 蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高對紫杉醇抗腫瘤細(xì)胞增殖的影響 Western結(jié)果顯示：隨著OGA抑制劑PUGNAc濃度的升高，乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平逐漸升高(P<0.05，見圖4A)。SRB結(jié)果顯示： 隨著紫杉醇濃度升高， 乳腺癌細(xì)胞存活率不斷降低；不同濃度OGA抑制劑PUGNAc對細(xì)胞增殖無影響。將不同濃度的PUGNAc和不同濃度的紫杉醇聯(lián)合，同時處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)PUGNAc可提高紫杉醇的抗細(xì)胞增殖活性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(結(jié)果未顯示)。先用不同濃度的PUGNAc處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，再加入不同濃度的紫杉醇處理48 h，結(jié)果顯示PUGNAc提前處理細(xì)胞可導(dǎo)致紫杉醇的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01，見圖4B)。表明PUGNAc導(dǎo)致的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高可引起細(xì)胞對紫杉醇的藥物敏感性增強(qiáng)。

圖4 不同濃度OGA抑制劑PUGNAc和不同濃度紫杉醇對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平(A)和細(xì)胞增殖抑制(B)的影響(n=3)A：*P<0.05；B：*P<0.05，**P<0.01，與單獨Taxol處理組比較Fig. 4 Effects of the combined treatment of OGA inhibitor with Taxol on protein O-GlcNAcylation levels (A) and cell growth (B)(n=3)A:*P<0.05;B:*P<0.05,**P<0.01, compared with Taxol treatment alone

2.4 蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平降低對紫杉醇抗增殖活性的影響 Western結(jié)果顯示：隨著OGT抑制劑alloxan濃度的升高，蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平逐漸降低(P<0.05，P<0.01，見圖5A)。SRB結(jié)果顯示：不同濃度alloxan處理MDA-MB-231細(xì)胞對細(xì)胞增殖無明顯影響。將不同濃度alloxan和不同濃度的紫杉醇聯(lián)合同時處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)alloxan對紫杉醇的抗腫瘤活性沒有顯著影響(結(jié)果未顯示)。先用不同濃度alloxan處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，再加入不同濃度的紫杉醇處理48 h，結(jié)果顯示alloxan提前處理細(xì)胞導(dǎo)致紫杉醇的抗腫瘤活性顯著降低(P<0.05，見圖5B)。表明，alloxan導(dǎo)致的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平降低可引起細(xì)胞對紫杉醇的藥物敏感性降低。

圖5 不同濃度OGT抑制劑alloxan和不同濃度紫杉醇聯(lián)合處理對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平(A)和細(xì)胞增殖抑制(B)的影響(n=3)A：*P<0.05，**P<0.01，與alloxan 0 μM組比較；B：*P<0.05，與單獨Taxol處理組比較Fig.5 Effects of the combined treatment of OGT inhibitor alloxan with Taxol on protein O-GlcNAcylation (A) and cell growth (B)(n=3)A:*P<0.05, **P<0.01, compared with alloxan 0 μM group;B:*P<0.05,compared with Taxol treatment alone

3 討論

與正常組織相比較，腫瘤組織中糖蛋白的糖鏈會發(fā)生明顯改變，常見的有N-糖鏈的分支增多，O-糖鏈的長度變短，糖鏈巖藻糖修飾、唾液酸修飾增加，O-GlcNAc糖基化增加等。糖鏈的變化影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移，影響藥物的抗腫瘤活性[4-5]。大量文獻(xiàn)證實N-糖基化或者O-糖基化的改變會影響藥物或者放療的抗腫瘤作用，如在腫瘤細(xì)胞中α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal1)高表達(dá)，導(dǎo)致糖鏈的α2，6-唾液酸化修飾增加，可引起腫瘤細(xì)胞對順鉑(cisplatin)和吉非替尼(gefitinib)的藥物敏感性降低[6-8]。腫瘤細(xì)胞中MGAT5基因高表達(dá)，可導(dǎo)致蛋白質(zhì) N-糖鏈多形成一個β1-6 GlcNAc連接的分支，研究MGAT5基因敲除的荷瘤小鼠(糖蛋白N-糖鏈的β1-6分支缺失)，發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤組織對VEGF抗體的藥物敏感性增強(qiáng)[9]?？鼓[瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的糖蛋白或糖鏈也產(chǎn)生影響。如接受多西他賽(docetaxel)和伊馬替尼(imatinibmesylate)聯(lián)合治療的卵巢癌患者，治療前后的血漿蛋白N-糖鏈含量水平存在差異[10]。但有關(guān)蛋白質(zhì) O-GlcNAc 糖基化和藥物相互作用關(guān)系的研究尚未見報道。

蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化在多種生命活動中發(fā)揮重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)4000種以上的蛋白質(zhì)是O-GlcNAc修飾的，但對于糖基化位點的鑒定目前還存在技術(shù)上的困難[11]。蛋白質(zhì) O-GlcNAc 糖基化分別通過和OGA和OGT這2種酶進(jìn)行去除或添加；UDP-GlcNAc是唯一的糖基供體，UDP-GlcNAc的合成是己糖胺合成途徑(HBP)的最后產(chǎn)物，谷氨酰胺6-磷酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)是唯一的限速酶；同時，UDP-GlcNAc的合成和糖酵解途徑密切相關(guān)[1,12]。在葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)的作用下葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)，大約有2%～5%的葡萄糖進(jìn)入HBP途徑，最終生成UDP-GlcNAc；其它大量的葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑，糖酵解存在己糖激酶(HK)、6-磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PKM)3種關(guān)鍵酶。在腫瘤細(xì)胞中，GFAT1、GLUT1、HK2、PFK1和PKM2是上述幾種酶的主要存在形式。

紫杉醇誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞微管蛋白聚合，抑制細(xì)胞分裂，被廣泛用于乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的治療，然而，細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性降低了其臨床治療效果[13]。本文通過研究蛋白質(zhì) O-GlcNAc 糖基化和紫杉醇的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高，且這種升高現(xiàn)象在另外2種乳腺癌細(xì)胞MCF-7和SKBR3中同樣存在(結(jié)果未顯示)，表明這種現(xiàn)象不是細(xì)胞依賴性的。為進(jìn)一步探討紫杉醇誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)糖基化水平升高的機(jī)制，測定了與蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化合成相關(guān)的多種酶的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示紫杉醇可誘導(dǎo)糖苷酶OGA的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；但其也可同時誘導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶OGT的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。紫杉醇促進(jìn)OGA和OGT蛋白水平同時升高，且升高的程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明OGA和OGT可能不是紫杉醇誘導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化升高的主要原因。紫杉醇可誘導(dǎo)細(xì)胞HK2表達(dá)水平升高，HK2的功能是把葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，接著轉(zhuǎn)化為果糖6-磷酸，部分的果糖6-磷酸進(jìn)入HBP途徑，最終生成UDP-GlcNAc；紫杉醇還可誘導(dǎo)GFAT1表達(dá)水平升高，而GFAT1是HBP途徑的唯一限速酶，因而推測，HK2和GFAT1參與了紫杉醇誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高，但還需要進(jìn)一步的驗證。紫杉醇對GLUT1、PFK1和PKM2的蛋白表達(dá)水平影響不大，表明這3種酶并未參與紫杉醇誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高。

PUGNAc是OGA的抑制劑，可通過抑制O-GlcNAc從糖基化蛋白質(zhì)上解離下來，從而升高蛋白質(zhì)O-GlcNAc的糖基化水平[14]。0.1、1.0、10μM的PUGNAc均可明顯升高蛋白質(zhì) O-GlcNAc 糖基化水平。PUGNAc和紫杉醇同時處理MDA-MB-231細(xì)胞，對紫杉醇的抗腫瘤活性影響不大；但PUGNAc處理細(xì)胞24h后再加入紫杉醇，紫杉醇的抗細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)，表明蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高促進(jìn)了紫杉醇的抗腫瘤活性。

Alloxan是OGT的抑制劑，本研究結(jié)果顯示使用不同濃度的alloxan并不能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，但可以降低蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平，這和文獻(xiàn)報道的一致[15]。Alloxan和紫杉醇同時處理MDA-MB-231細(xì)胞，對紫杉醇的抗腫瘤活性影響不大；但alloxan處理細(xì)胞24 h后再加入紫杉醇，紫杉醇的抗細(xì)胞增殖活性明顯降低，表明蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平下降抑制了紫杉醇的抗腫瘤活性。

綜上所述，紫杉醇可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高，OGA和OGT的蛋白和mRNA水平都隨著紫杉醇的濃度升高而升高，改變蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平影響細(xì)胞對紫杉醇的藥物敏感性，進(jìn)一步研究其中的分子機(jī)制，對提高紫杉醇的抗腫瘤活性具有重要意義。

[1] Bond MR,Hanover JA.A little sugar goes a long way: the cell biology of O-GlcNAc [J].J Cell Biol,2015,208(7):869-880.

[2] deQueiroz RM,Carvalho E,Dias WB.O-GlcNAcylation: the sweet side of the cancer[J].Front Oncol,2014,4：00132.

[3] Ma Z,Vosseller K.O-GlcNAc in cancer biology[J].Amino Acids,2013,45(4):719-733.

[4] Christiansen MN,Chik J,Lee L,et al.Cell surface protein glycosylation in cancer[J].Proteomics,2014,14(4-5):525-546.

[5] Lange T,Samatov TR,Tonevitsky AG,et al.Importance of altered glycoprotein-boundN- andO-glycans for epithelial-to-mesenchymal transition and adhesion of cancer cells[J].Carbohydr Res,2014,389:39-45.

[6] Büll C,Stoel MA,denBrok MH,et al.Sialic acids sweeten a tumor’s life[J].Cancer Res,2014,74(12):3199-3204.

[7] Park JJ,Lee M.Increasing the α 2,6 sialylation of glycoproteins may contribute to metastatic spread and therapeutic resistance in colorectal cancer[J].Gut Liver,2013,7(6):629-641.

[8] Park JJ,Yi JY,JinYB,et al.Sialylation of epidermal growth factor receptor regulates receptor activity and chemosensitivity to gefitinib in colon cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2012,83(7):849-857.

[9] Croci DO,Cerliani JP,Dalotto-Moreno T,et al.Glycosylation-Dependent Lectin-Receptor Interactions Preserve Angiogenesis in Anti-VEGF Refractory Tumors[J].Cell,2014,156(4):744-758.

[10] Han YY,Liu HY,Han DJ,et al.Role of glycosylation in the anticancer activity of antibacterial peptides against breast cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2013, 86(9):1254-1262.

[11] Ma J,Hart GW.O-GlcNAcprofiling:from proteins to proteomes[J].Clin Proteomics,2014,11(1):8.

[12] 鄧瑞萍，郭書娟，陶生策.O-GlcNAc糖基化功能研究最新進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2013，25(5)：502-510.

[13] Dostál V,Libusová L.Microtubuledrugs:action, selectivity, and resistance across the kingdoms of life[J].Protoplasma,2014,251(5):991-1005.

[14] Banerjee PS,Hart GW,Cho JW.Chemical approaches to study O-GlcNAcylation[J].Chem Soc Rev,2013,42(10):4345-4357.

[15] Lee TN,Alborn WE,Knierman MD,et al.Alloxan is an inhibitor of O-GlcNAc-selective N-acetyl-β-d-glucosaminidase[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,350(4):1038-1043.

(編校：吳茜)

Relationship of protein O-GlcNAcylation levels with antitumor effect of Taxol in breast cancer

ZHANG Xiao-bing, LI Hui, WANG Feng-shan, SHI Yi-kangΔ

(School of Pharmaceutical Sciences/National Glycoengineering Research Center, Shandong University, Ji′nan 250012, China)

ObjectiveTo study effect of Taxol on protein O-GlcNAcylation levels and investigate whether protein O-GlcNAcylation levels can affect the sensitivity of breast cancer cells to Taxol.MethodsWestern blot analysis was performed to examine protein O-GlcNAcylation levels and the expression of enzymes related to O-GlcNAcylation biosynthesis in Taxol treated breast cancer cells. RT-qPCR was used to analyze the effects of Taxol on OGA and OGT mRNA expression in cancer cells. The sulforhodamine B colorimetric assay was used to determine the effect of alteration of protein O-GlcNAcylation on the anti-proliferation of Taxol in breast cancer cells by adding OGA inhibitor and OGT inhibitor, respectively.ResultsTaxol treatment enhanced protein O-GlcNAcylation levels in dose- and time-dependent manners in breast cancer cell MDA-MB-231(P<0.05). Taxol increased the mRNA levels of OGT and OGA after MDA-MB-231 cells were treated for 24 h(P<0.05). As OGA inhibitors increased protein O-GlcNAcylation levels, the sensitivity of MDA-MB-231 to Taxol was increased. As OGT inhibitor decreased protein O-GlcNAcylation levels, the sensitivity of MDA-MB-231 to Taxol was reduced.ConclusionTaxol treatment can enhance protein O-GlcNAcylation levels and the changes of O-GlcNAcylation levels alter the sensitivity of breast cancer cell MDA-MB-231 to Taxol.

O-Glycosylation;Taxol;β-N-acetylglucosaminidase; β-N-acetylglucosaminyltransferase

國家自然科學(xué)基金(81272208)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2009CM046)

張肖冰，女，碩士，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：2532928372@qq.com；師以康，通訊作者，男，博士，副教授，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：shiyikang@sdu.edu.cn。

R966

A

1005-1678(2015)05-0001-05