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    HPLC法測定小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸含量

    2015-07-07 15:54:09陳宇梁蔚陽
    中國生化藥物雜志 2015年5期
    關鍵詞:酪氨酸乙酰復方

    陳宇,梁蔚陽

    (廣東省食品藥品檢驗所,廣東 廣州 510180)

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    HPLC法測定小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸含量

    (廣東省食品藥品檢驗所,廣東 廣州 510180)

    目的 建立測定小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸含量的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)。方法 采用Agilent 1200型高效液相色譜儀,使用Agilent Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.0 mm,5 μm),以20 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調節(jié)pH值至2.5)-乙腈(90:10)為流動相,流速1.0 mL/min,檢測波長210 nm,柱溫25 ℃。結果 乙酰酪氨酸峰與其他氨基酸色譜峰分離度良好,乙酰酪氨酸在12.062~120.62 μg/mL范圍內呈良好的線性關系(r=0.9999),平均加樣回收率(n=9)為100.0%,RSD%(n=9)為0.9,其定量限(S/N=10)為0.15 μg/mL。結論 建立的HPLC法可用于小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸的質量控制。

    乙酰酪氨酸;小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ); HPLC

    小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)是由19種氨基酸配制而成的滅菌水溶液,主要治療早產兒、低體重兒及各種病因所致不能經口攝入蛋白質或攝入量不足的新生兒和因燒傷、外傷及手術等高代謝狀態(tài)的小兒[1]。最近臨床上還將其與葉酸片、葡萄糖酸鋅或小劑量654-2片聯(lián)合用藥,用于治療小兒輪狀病毒感染性腸炎、遷延性腹瀉等疾病[2-5]。小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)原為北京制藥廠研發(fā)生產,現(xiàn)行質量標準收載于國家藥品標準新藥轉正標準第48冊WS1-(X-507)-2003Z,其酪氨酸的處方量為1.4 mg/mL[6]。但酪氨酸在水中溶解度極低,約為0.5 mg/mL。經過模擬處方試驗發(fā)現(xiàn)如按標準處方量投料生產,樣品有大量結晶析出,說明其處方存在問題[7]。小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的質量標準中采用紫外分光光度法測定酪氨酸含量,該方法專屬性低,無法準確測得樣品中酪氨酸的量。

    在前期的實驗中,分別采用Waters AccQ-Tag法和Agilent OPA/FMOC法測定樣品中酪氨酸的含量,約為0.4 mg/mL[8-9]。上述2種方法的原理是利用衍生物與氨基酸的伯胺基或仲胺基發(fā)生反應,生成具有熒光或紫外吸收的物質,從而通過色譜分離測得吸收值[10]。根據(jù)以上實驗分析,樣品中含有的物質可能為分子結構中帶有芳香環(huán)和叔胺基的乙酰酪氨酸。

    本文擬通過HPLC法對乙酰酪氨酸與其他氨基酸進行有效分離,考察小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)是否含有乙酰酪氨酸,并對其含量進行方法學驗證。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑 酪氨酸、苯丙氨酸、乙酰酪氨酸、色氨酸(中國食品藥品檢定研究院,批號分別為:140609-201212、140676-200405、140672-200501、140686-201303)。生產企業(yè)A,樣品1批(批號:Y1211222);生產企業(yè)B,樣品3批(批號:20130401,20130402,20130403);生產企業(yè)C,樣品1批(批號:C13013104)。磷酸二氫鈉與磷酸(分析純,廣州化學試劑廠);乙腈(色譜純,Merck);超純水。

    1.2 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent Hypersil ODS(250 mm×4.0 mm,5 μm)(美國Agilent公司);Waters 2695/2487高效液相色譜儀、Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱(美國Waters公司);Millipore超純水發(fā)生儀(美國Millipore公司);Sartorius PB-10 pH計(德國Sartorius公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件:色譜柱:Agilent Hypersil ODS(250 mm×4.0 mm,5 μm);流動相:20 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調節(jié)pH值至2.5)-乙腈(90:10);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:210 nm;進樣量:10 μL。

    1.3.2 溶液的制備

    ① 系統(tǒng)適用性溶液:取酪氨酸、苯丙氨酸、乙酰酪氨酸和色氨酸對照品適量,用流動相溶解并稀釋制成每 1 mL 中約含酪氨酸16 μg、苯丙氨酸116 μg、乙酰酪氨酸48 μg和色氨酸48 μg的混合溶液,即得。

    ② 對照品溶液:精密稱取乙酰酪氨酸適量,用流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含48 μg的溶液,即得。

    ③ 供試品溶液:精密量取本品適量,用流動相稀釋制成每1 mL中約含乙酰酪氨酸48 μg的溶液,即得。

    1.3.3 系統(tǒng)適用性試驗:取“1.3.2”項下的①溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

    1.3.4 線性試驗:精密稱取乙酰酪氨酸對照品適量,用流動相溶解并定量稀釋制成含乙酰酪氨酸12.062~120.62 μg/mL的溶液,參照“1.3.1”項下的色譜條件,進樣測定。

    1.3.5 定量限與檢測限:取“1.3.2”項下的②對照品溶液逐級定量稀釋,進樣并記錄色譜圖,按信噪比(S/N)分別為10和3計算定量限和檢測限。

    1.3.6 精密度試驗:精密量取“1.3.2”項下的對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖,計算峰面積。

    1.3.7 重復性試驗:取生產企業(yè)B(批號:20130401)的樣品,參照“1.3.2”項下③的方法配制供試品溶液6份,按“1.3.1”項下方法進樣。

    1.3.8 加樣回收率試驗:取乙酰酪氨酸對照品分別用流動相溶解并稀釋至成濃度為0.96、1.2、1.44 mg/mL的貯備液,精密量取上述溶液1 mL,分別置50 mL量瓶中,加入同批號樣品(生產企業(yè)A,批號為20130401,乙酰酪氨酸為1.2 mg/mL)1 mL,按“1.3.1”項下的方法配制加樣回收率溶液,各進樣10 μL,記錄色譜圖。

    1.4 樣品測定 參照“1.3.2”項下的方法配制對照品溶液與供試品溶液,參照“1.3.1”項下的色譜條件進樣,按外標法以峰面積計算乙酰酪氨酸的含量。

    1.5 耐用性試驗 除高效液相色譜儀為Waters 2695/2487檢測器,色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)外,其他按“1.3.1”項下的色譜條件進樣,按外標法以峰面積計算乙酰酪氨酸的含量。

    1.6 結果比較 參考小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的質量標準WS1-(X-507)-2003Z,采用紫外分光光度法對5批樣品的酪氨酸含量進行測定,與采用Waters AccQ-Tag和HPLC法測得酪氨酸與乙酰酪氨酸的量進行比較。

    2 結果

    2.1 系統(tǒng)適用性試驗 乙酰酪氨酸的保留時間約為5.8 min,乙酰酪氨酸峰與苯丙氨酸峰、乙酰酪氨酸峰與色氨酸峰的分離度均為6.6,理論板數(shù)按乙酰酪氨酸峰計為12107,見圖1。

    圖1 系統(tǒng)適用性試驗圖譜Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

    2.2 線性試驗 以進樣濃度(X,μg/mL)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸,得回歸方程為Y=11.38X-1.092,相關系數(shù)為0.9999。結果表明,乙酰酪氨酸在上述濃度范圍內線性關系良好。

    2.3 定量限和檢測限試驗 乙酰酪氨酸的定量限為0.15 μg/mL,檢測限為0.05 μg/mL。

    2.4 精密度試驗和重復性試驗 精密度試驗測定其峰面積的RSD(n=6)為0.1%。表明儀器的精密度良好。重復性試驗表明乙酰酪氨酸峰面積的RSD(n=6)為0.5%。

    2.5 加樣回收率試驗 乙酰酪氨酸的加樣回收率為100.0%,RSD值為0.9%。結果表明,該方法有良好的回收率。

    2.6 樣品測定結果 樣品測定結果及耐用性試驗結果見表1,圖2。

    表1 樣品測定結果及耐用性試驗結果Tab.1 Determination and robustness results of samples

    圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the sample

    2.7 不同測定方法的結果比較 不同方法測定酪氨酸與乙酰酪氨酸的含量比較,見表2。

    表2 結果比較Tab.2 Comparison of results

    3 討論

    大多數(shù)高效液相色譜法測定氨基酸含量的原理是利用衍生物與氨基酸的伯胺基或仲胺基發(fā)生化學反應,生成具有熒光或紫外吸收的物質,從而通過色譜分離測得吸收值。采用Waters AccQ-Tag方法對以上5批樣品進行氨基酸含量分析,其酪氨酸含量均約為0.4 mg/mL,低于酪氨酸處方量(1.4 mg/mL),說明可能存在生產企業(yè)未按申報的工藝進行生產的情況。5批樣品中乙酰酪氨酸的量(以酪氨酸計)與酪氨酸的量之和約為1.4 mg/mL,與其處方量接近,說明處方中酪氨酸的量是乙酰酪氨酸與酪氨酸的含量之和。

    小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)的現(xiàn)行標準規(guī)定,采用紫外分光光度法測定酪氨酸的量,其專屬性差,不能有效分離酪氨酸與乙酰酪氨酸。采用高效液相色譜法對小兒復方氨基酸注射液(19AA-Ⅰ)中乙酰酪氨酸的量進行測定,能有效控制其質量。

    在試驗過程中使用Waters Symmetry C18與Agilent Hypersil ODS色譜柱時發(fā)現(xiàn),乙酰酪氨酸與色氨酸的出峰順序倒置,可能是由于不同品牌的C18色譜柱填料存在一定差異造成的。使用以上2種色譜柱時,乙酰酪氨酸峰與相鄰氨基酸色譜峰均能達到分離度的要求,不影響測定結果。

    [1] 李妮.小兒復方氨基酸的臨床飲用與護理[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2012,28(6):919-920.

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    [6] 國家藥典委員會.國家藥品標準新藥轉正標準第48冊[M].北京:國家藥典委員會,2004:85-87.

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    [9] 陸明,孫黛妮,汪楊,等.OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法測定復方氨基酸注射液中氨基酸的含量[J].藥物分析雜志,2010,30(12):2323-2327.

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    (編校:王冬梅)

    Determination of content of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ) by HPLC

    CHEN Yu-kun, LIANG Wei-yangΔ

    (Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China)

    ObjectiveTo establish a method for HPLC to determine content of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ).MethodsThe chromatographic separation was achieved on a Agilent Hypersil ODS column (250 mm×4.0 mm,5 μm) with Agilent 1200 liquid chromatography system.The mobile phases consisted of 20 mmol/L sodium dihydrogen phosphate solution (adjusting pH to 2.5 with phosphoric acid)-acetonitrile (90:10) at a flow rate of 1.0 mL/min, the detection wavelength was 210 nm, the column temperature was 25 ℃.ResultsAcetyl tyrosine was completely separated from other amino acids.The calibration curves for acetyl tyrosine revealed good linearity in the range of 12.062-120.62 μg/mL(r=0.9999).The average recoveries (n=9) of acetyl tyrosine was 100.0%, RSD% (n=9) was 0.9.The limits of quantification (S/N=10) was 0.15 μg/mL.ConclusionThe methodological validation results indicate that the established method can be applied to quality control of acetyl tyrosine in pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ).

    acetyl tyrosine;pediatric compound amino acid injection (19AA-Ⅰ);HPLC

    陳宇堃,女,本科,主管藥師,研究方向:生化藥品檢驗,E-mail:bettycyk@163.com;梁蔚陽,通訊作者,女,碩士,主任藥師,研究方向:生化藥品及生物制品質量控制工作;E-mail: wl-1023@163.com。

    R927.2

    A

    1005-1678(2015)05-0166-03

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