多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選清熱解毒口服液的提取工藝

高天曙，王會(huì)麗，趙義紅

(1.河南省中醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450004；2.河南省中醫(yī)藥研究院 肝膽脾胃科，河南 鄭州 450004；3.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 趙國(guó)岑名醫(yī)工作室，河南 鄭州 450000)

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多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選清熱解毒口服液的提取工藝

高天曙1，王會(huì)麗2，趙義紅3

(1.河南省中醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450004；2.河南省中醫(yī)藥研究院 肝膽脾胃科，河南 鄭州 450004；3.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 趙國(guó)岑名醫(yī)工作室，河南 鄭州 450000)

目的 優(yōu)選清熱解毒口服液最佳提取工藝。方法 以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)和含醇百分率為考察因素，每因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以黃芩苷、綠原酸和梔子苷轉(zhuǎn)移率及浸膏得率為指標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)綜合評(píng)價(jià)， 用L9(34) 正交表安排試驗(yàn)。結(jié)果 清熱解毒口服液最佳的提取工藝為加8倍量水提取3次，每次1h，含醇百分率為70%。結(jié)論 驗(yàn)證試驗(yàn)表明通過(guò)正交試驗(yàn)得到的清熱解毒口服液提取工藝設(shè)計(jì)合理，結(jié)果可靠，提取效果較好，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

多指標(biāo)綜合評(píng)分；清熱解毒口服液；正交試驗(yàn)；提取工藝

清熱解毒口服液由金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子等12味中藥組成，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊(cè)[1]，方中重用石膏清熱瀉火，生津止渴為君藥；梔子、黃芩、龍膽清熱瀉火，雙花、連翹、甜地丁、板藍(lán)根清熱解毒，玄參、生地黃清熱涼血，諸藥均助君藥清熱瀉火解毒為臣藥；知母、麥冬清熱生津?yàn)樽羲帲星鍩峤舛?、生津止渴等功效。本文采用L9(34) 正交試驗(yàn)表，以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)和含醇百分率為考察因素[2-3]，以黃芩苷、綠原酸和梔子苷3者的含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選研究，以期為臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 處方藥材(江蘇省醫(yī)藥公司)，經(jīng)鑒定均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201016)；綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201314)；梔子苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110749-201316)。

1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括1525溶液輸送泵、2487紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器; Breeze工作站(購(gòu)自Waters公司)；JK-5200型超聲波清洗器(購(gòu)自合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)；XS205DU電子天平(購(gòu)自梅特勒有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純(Fisher公司)，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 浸膏得率的測(cè)定[2]：將按正交試驗(yàn)得到的各樣品提取液分別轉(zhuǎn)移至1000 mL量瓶中，加水定容，各精密量取20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?05 ℃干燥至恒重，放冷至室溫后稱重，計(jì)算浸膏得率。

1.3.2 黃芩的含量測(cè)定：① 色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(50︰50 ︰0.3)；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；柱溫：室溫。

② 對(duì)照品溶液的制備： 精密稱取黃芩苷對(duì)照品(五氧化二磷減壓干燥至恒重)加70%乙醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

③ 供試品溶液的制備： 精密量取按正交試驗(yàn)得到的各樣品提取液2 mL，置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量，振搖，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

④ 陰性樣品溶液的制備：按照清熱解毒口服液的處方制備不含黃芩的樣品，按照③項(xiàng)下的方法操作，制成陰性樣品溶液。

⑤ 線性關(guān)系的考察：精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含黃芩苷50 μg的溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液2、8、10、12、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分別加70%乙醇定容至刻度，搖勻，制得不同濃度的對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液，按照1.3.2 項(xiàng)下①色譜條件分別進(jìn)樣10 μL 分析，記錄峰面積。

⑥ 精密度實(shí)驗(yàn)：精密量取黃芩苷對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。

⑦ 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取同一黃芩苷對(duì)照品溶液10 μL，室溫放置，分別在0、2、4、 6、 8、24 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，考察其溶液穩(wěn)定性。

⑧ 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品提取液2 mL，共6份，分別置100 mL量瓶中，各精密加入適量的黃芩苷對(duì)照品溶液，加70%乙醇適量，振搖，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得，精密量取上述溶液10 μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算回收率(以黃芩苷計(jì))。

1.3.3 金銀花的含量測(cè)定：

① 色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87)；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；柱溫：室溫。

② 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL中含綠原酸20 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

③ 供試品溶液的制備：精密量取按正交試驗(yàn)得到的各樣品提取液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇適量，振搖，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

④ 陰性樣品溶液：按照清熱解毒口服液的處方制備不含金銀花的樣品，照③項(xiàng)下的方法操作，制成陰性樣品溶液。

⑤ 線性關(guān)系的考察：精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含綠原酸100 μg的溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液2、8、10、12、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分別加50%甲醇定容至刻度，搖勻，制得不同濃度的對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液，按照1.3.3 項(xiàng)下①色譜條件分別進(jìn)樣10 μL 分析, 記錄峰面積。

⑥ 精密度實(shí)驗(yàn)：精密量取綠原酸對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。

⑦ 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取同一綠原酸對(duì)照品溶液10 μL，室溫放置，分別在0、 2、 4、 6、 8、 24 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，考察其溶液穩(wěn)定性。

⑧ 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品提取液1 mL，共6份，分別置25 mL量瓶中，各精密加入適量的綠原酸對(duì)照品溶液，加50%甲醇適量，振搖，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得，精密量取上述溶液10 μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算回收率。

1.3.4 梔子的含量測(cè)定：

① 色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相 ：乙腈-水(12︰88)；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：室溫。

② 對(duì)照品溶液：精密稱取梔子苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

③ 供試品溶液：精密量取按正交試驗(yàn)得到的各樣品提取液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇適量，振搖，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

④ 陰性樣品溶液：按照清熱解毒口服液的處方制備不含梔子的樣品，按照1.3.4項(xiàng)下②的方法操作，制成陰性樣品溶液。

⑤ 線性關(guān)系的考察：精密稱取梔子苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含梔子苷250 μg的溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液2、8、10、15、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分別加50%甲醇定容至刻度，搖勻，制得不同濃度的對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液，按1.3.4 項(xiàng)下①色譜條件分別進(jìn)樣10 μL分析, 記錄峰面積。

⑥ 精密度實(shí)驗(yàn)：精密量取梔子苷對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次。

⑦ 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密吸取同一梔子苷對(duì)照品溶液10 μL，室溫放置，分別在0、2、4、6、 8、24 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，考察其溶液穩(wěn)定性。

⑧ 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品提取液1 mL，共6份，分別置25 mL量瓶中，各精密加入適量的梔子苷對(duì)照品溶液，加50%甲醇適量，振搖，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得，精密量取上述溶液10 μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算回收率。

1. 3 樣品含量測(cè)定 分別精密量取正交試驗(yàn)項(xiàng)下1～9號(hào)樣品溶液各10 μL，分別按照“1.3.2”“1.3.3”及“1.3.4”項(xiàng)下①色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定各成分峰面積。

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝 根據(jù)生產(chǎn)工藝并結(jié)合處方中各藥材的理化性質(zhì)來(lái)選擇考察因素，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，浸泡時(shí)間(浸泡1h即可)對(duì)提取效果的影響很小，故本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)提取效果影響較大的加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)和含醇百分率4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，每因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以黃芩苷、綠原酸和梔子苷轉(zhuǎn)移率及浸膏得率為指標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)綜合評(píng)價(jià)，因素水平表選擇L9(34) 正交表，見(jiàn)表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factor and level of orthogonal design

1.5 正交試驗(yàn)方法[4]按處方比例稱取9個(gè)處方量的金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子等十二味藥材，先溫浸1 h，分別按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行煎煮(待沸騰后，稍冷加金銀花和黃芩)，濾過(guò)，合并濾液，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.17，最后加入一定量的乙醇，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行提取，各提取液均冷藏48 h，濾過(guò)，回收乙醇，加入0.5%的活性碳，加熱30 min，濾過(guò)，濾液加水至1000 mL，定容，備用。

2 結(jié)果

2.1 黃芩的含量測(cè)定

2.1.1 黃芩苷的線性方程：以平均峰面積(A)為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣的質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程Y=5.01×105+4.35×103(r=0.9993)，由結(jié)果可知，黃芩苷的線性范圍為2～25 mg/L 。

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn)：黃芩苷峰面積的RSD為1.56%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：黃芩苷峰面積的RSD為1.7 8%，表明黃芩苷對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：結(jié)果測(cè)得黃芩苷的平均回收率為100.28%，RSD=1.79%(n=6)。

2.2 金銀花的含量測(cè)定

2.2.1 綠原酸的線性方程：以平均峰面積(A)為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣的質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，得綠原酸的回歸方程Y=6.37×105-7.03×104(r=0.9996)，由結(jié)果可知，綠原酸的線性范圍為4～50 mg/L 。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)：綠原酸峰面積的RSD為1.61%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：綠原酸峰面積的RSD為2.19%，表明綠原酸對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：結(jié)果測(cè)得綠原酸的平均回收率為97.82%，RSD=2.21%(n=6)。

2.3 梔子的含量測(cè)定

2.3.1 綠原酸的線性方程：以平均峰面積(A)為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣的質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，得梔子苷的回歸方程Y=5.73×104-3.79×103(r=0.9997)，由結(jié)果可知，梔子苷的線性范圍為10～125 mg/L。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)：梔子苷峰面積的RSD為1.72%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：梔子苷峰面積的RSD為1.57%，表明梔子苷對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：結(jié)果測(cè)得梔子苷的平均回收率為99.73%，RSD=1.62(n=6)。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the orthogonal )

注：綜合評(píng)分=0.4×W黃芩苷量/WMax黃芩苷量+0.2×W綠原酸量/WMax綠原酸量+0.3×W梔子苷量/WMax梔子苷量-0.1×W浸膏得率/WMax浸膏得率

本實(shí)驗(yàn)對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了加權(quán)綜合評(píng)分分析，加權(quán)綜合評(píng)分[5-8], 是指運(yùn)用數(shù)學(xué)方法對(duì)復(fù)雜體系中的多個(gè)指標(biāo)信息進(jìn)行分析處理，根據(jù)復(fù)雜體系中各指標(biāo)信息的貢獻(xiàn)大小給予它們不同的權(quán)重系數(shù)。根據(jù)清熱解毒口服液的處方及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)各主要成分的含量規(guī)定來(lái)分配權(quán)重系數(shù)，即黃芩苷0.4，綠原酸0.2，梔子苷0.3，浸膏0.1。因?yàn)楸局苿榭诜?，浸膏越少，澄明度及穩(wěn)定性越好，所以浸膏得率為負(fù)向指標(biāo)，其余3項(xiàng)均為正項(xiàng)指標(biāo)。

表3 方差分析表Tab.3 Table of variance analysis

由以上表格直觀分析可知，對(duì)于黃芩苷，各因素影響程度的大小為：C>A>D>B，對(duì)于綠原酸，各因素影響程度的大小為：C>D>A>B，對(duì)于梔子苷，各因素影響程度的大小為：C>A>B>D，對(duì)于負(fù)向指標(biāo)浸膏得率，各因素影響程度的大小為：C>D>B>A，對(duì)各影響因素加權(quán)后綜合評(píng)分分析，各因素順序?yàn)椋篊>D>A>B，即提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響是最大的，其次是含醇量和加水量，最后是提取時(shí)間?？梢?jiàn)，在提取次數(shù)滿足一定要求后，提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響不是很明顯；另外，加水量和含醇量是藥材中有效成分能提取完全的前提，本提取方法采用的是“水提醇沉”工藝，包含水溶性有效成分的充分溶出和雜質(zhì)的過(guò)濾，含水量和含醇量對(duì)于本工藝來(lái)說(shuō)是兩個(gè)非常重要的指標(biāo)。

下面分析各影響因素指標(biāo)在各水平的排列順序：

黃芩苷：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1;

綠原酸: A1>A3>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1;

梔子苷：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D2>D3>D1;

浸膏：A3>A2>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D1>D2>D3;

加權(quán)綜合評(píng)分：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果 經(jīng)直觀分析和方差分析并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)工藝的情況，得出選清熱解毒口服液最佳提取工藝為A2B2C3D3，即加8倍量的水提取3次，每次1h，然后加入乙醇精提，使含醇量達(dá)到70%。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方組成比例稱取3份藥材，采用優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 優(yōu)選工藝驗(yàn)證結(jié)果(n=3，%)Tab.4 Validation results of the optimized test (n=3,%)

3 討論

由于綠原酸是熱不穩(wěn)定性化合物[9]，不宜長(zhǎng)時(shí)間加熱，而通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響是最大的，在提取次數(shù)滿足一定要求時(shí)，提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響不是很明顯，因此在選擇提取時(shí)間上，本研究選擇了B2，即1 h,這個(gè)結(jié)果與以往綠原酸的提取時(shí)間吻合[10-11]。

本處方提取采用的是“水提醇沉”工藝[12-14]，“水提醇沉”工藝法是常用于中藥水提取液的純化精制方法，藥材先經(jīng)水煎提取，其中生物堿、有機(jī)酸鹽、氨基酸類等水溶性有效成分被提取出來(lái)，同時(shí)也浸提出很多水溶性雜質(zhì)，然后在提取液中加入一定量的乙醇，利用有效成分能溶于乙醇而雜質(zhì)不溶于乙醇的特性，將有效成分轉(zhuǎn)溶于乙醇中而使雜質(zhì)沉淀出來(lái)?！八岽汲痢钡牡谝粋€(gè)前提是加水量，加水量對(duì)藥材中有效成分的充分溶出有很大的影響，而含醇量則是將有效成分進(jìn)行精提的關(guān)鍵，含醇量過(guò)多，藥材中有效成分損失嚴(yán)重；含醇量太低則會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)過(guò)多。

綜上所述，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，選擇了加8倍量的水提取3次，每次1h，然后加入乙醇精提，使含醇量達(dá)到70%。

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(編校：王冬梅)

Optimize the extraction process of Qingrejiedu oral liquid by multi-index comprehensive evaluation

GAO Tian-shu1, WANG Hui-li2, ZHAO Yi-hong3

(1.Department of Pharmacy, Henan Traditional Chinese Medicine Hospital, zhengzhou 450004, China; 2.Department of Liver and Spleen, Henan Chinese Medicine Research Institute,zhengzhou 45000, China; 3. Doctor Zhao Guocen Studio, Affiliated Hospital of Henan Chinese Medicine Research Institute, zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo optimize the extraction techique for Qingrejiedu oral liquid.MethodsThe amount of water, extraction time , extraction times and alcohol content were used as inspection factor, 3 levels per factor, with baicalin, chlorogenic acid , geniposide transfer rate and extraction rate as indexes,carries on Weighted comprehensive evaluation,the optimal extractin were screened by L9(34) orthogonal test.ResultsThe optimal extraction condition of Qingrejiedu oral liquid were as follow:extraction for 3 times and 1h each time with 8-fold amount of water and 70% alcohol.ConclusionThrough the orthogonal test, the extraction process of Qingrejiedu oral liquid is designed reasonably, the result is reliable, and the extraction effect is good, and has higher application value.

multi-index comprehensive evaluation; Qingrejiedu oral liquid; orthogonal test; extraction process

高天曙，男，本科，主管藥師，研究方向: 中藥藥理與中藥臨床研究，E-mail： 3157797926@qq.com。

R969.3

B

1005-1678(2015)07-0141-04