糖皮質(zhì)激素通過線粒體途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡

趙碩，李成

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 質(zhì)量控制辦公室，遼寧 錦州 121000)

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糖皮質(zhì)激素通過線粒體途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡

趙碩，李成Δ

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 質(zhì)量控制辦公室，遼寧 錦州 121000)

目的 探索糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制，為臨床防治激素性股骨頭壞死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 將MC3T3-E1細(xì)胞分為control group及3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別采用不同濃度地塞米松(1、10、100 μmol/L)干預(yù)24 h后，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，JC-1染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體跨膜電位，胞質(zhì)線粒體蛋白分離提取后Western blot檢測(cè)線粒體Bax、Bcl-2及胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)表達(dá)。結(jié)果 隨Dex干預(yù)濃度的增加，成骨細(xì)胞凋亡率顯著性升高(F(3,28)=159.0，P=0.000)，JC-1陽(yáng)性細(xì)胞率顯著性升高(F(3,28)=499.5，P=0.000)，線粒體內(nèi)Bax(F(3,28)=17.4，P=0.000)、胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C(F(3,28)=22.4，P=0.000)與AIF(F(3,28)=42.61，P=0.000)表達(dá)均顯著性上調(diào)。各實(shí)驗(yàn)組以上指標(biāo)與control group相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)。但各組線粒體內(nèi)Bcl-2表達(dá)無顯著性差異(F(3,28)=0.62，P=0.607)。結(jié)論 地塞米松通過上調(diào)線粒體內(nèi)Bax表達(dá)，促使線粒體敏感性轉(zhuǎn)化孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)過度開放，經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

地塞米松；成骨細(xì)胞；凋亡

目前，糖皮質(zhì)激素的使用已成為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首要病因[1]，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在激素性股骨頭壞死標(biāo)本內(nèi)存在著大量的成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞凋亡，而在其他因素導(dǎo)致的股骨頭壞死標(biāo)本中卻未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象[2]。其后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)大劑量糖皮質(zhì)激素可引起成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞活性改變，凋亡是激素性骨壞死的首要變化[3-4]。因此有學(xué)者提出，GC誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞凋亡與激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，認(rèn)為細(xì)胞凋亡是激素性股骨頭壞死發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[5-6]。這一理論的提出為激素性股骨頭壞死的病因?qū)W研究開辟了新的方向，但其凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前尚未明確。

目前已知細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至少有3條：線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路，其中線粒體通路最為經(jīng)典[7]。本研究通過對(duì)不同濃度地塞米松(dexamethasone,Dex)干預(yù)后成骨細(xì)胞凋亡率、線粒體跨膜電位及線粒體相關(guān)凋亡蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與定位的研究，探索激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為臨床防治激素性股骨頭壞死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：MC3T3-E1成骨細(xì)胞株購(gòu)自ATCC (ATCC CRL-2596，USA)。

1.1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco，Dex和PBS購(gòu)自Sigma,TUNEL試劑盒購(gòu)自普洛麥格， JC-1試劑盒購(gòu)自碧云天，胞質(zhì)和線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，I抗兔抗鼠Bcl-2、Bax、AIF、Cyt-C單抗購(gòu)自武漢博士德，II抗辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉。

1.1.3 儀器：正置光學(xué)顯微鏡(CX31，OLYMPUS公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSVantage SE,美國(guó)BD公司)，CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 150i,Thermo公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-10C，上海安亭科學(xué)儀器廠)，恒壓恒流電泳儀(HC360，北京市六一儀器廠)，SDS-PAGE垂直電泳槽(MP-8000，北京凱元信瑞生物科技有限公司)，掃描儀(Bio-5000，MICROTEK )，分光光度計(jì)(UV2550,日本SHIMODZU)，冷凍離心機(jī)(CT15RE，日本HITACHI)，漩渦振蕩器(VORTEX3000，德國(guó)WIGGENS)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞充分混勻、分散，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，按0.5 mL/孔接種于24孔板。設(shè)置control group及3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組8孔，實(shí)驗(yàn)組分別添加不同濃度Dex(1、10、100 μmol/L)0.5 mL于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗2次,4%多聚甲醛固定20 min。PBS漂洗3次，3%H2O2室溫(15 ℃～25 ℃)封閉10 min；滴加100 μL TdT 酶反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)60 min，PBS漂洗后DAB溶液顯色，蘇木素常規(guī)染液復(fù)染，光鏡觀察。

1.4 JC-1檢測(cè)線粒體跨膜電位 細(xì)胞加藥處理后，常規(guī)消化，用PBS洗1次后，加入JC-1工作液(300 nmol/L)，37 ℃孵育30 min后，JC-1緩沖液洗滌3次，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析JC-1陽(yáng)性率。

1.5 線粒體、胞質(zhì)內(nèi)蛋白分離提取 冷PBS洗滌細(xì)胞，細(xì)胞懸液中加入1 mL胞質(zhì)提取Buffer，冰上均質(zhì)，渦旋震蕩15 s,放置冰上15 min，離心，保存沉淀；取上清轉(zhuǎn)移至新冷離心管，4 ℃,12000 r/min離心30 min，上清移入新管，為胞質(zhì)蛋白，-80 ℃冷凍保存；將之前沉淀加入0.1mL胞質(zhì)提取Buffer，渦旋震蕩30 s，13000 r/min離心10 min，棄上清；在沉淀中加入0.1 mL的線粒體溶解Buffer，冰上放置30 min，渦旋振蕩30 s；4 ℃ 13000 r/min離心10 min，收集上清，為線粒體蛋白，-80°C冷凍保存。

1.6 Western blot BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取30 μg上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶+牛血清白蛋白4 ℃冰箱封閉過夜，加一抗(稀釋比例1:2000，)勻速搖床孵育3 h后漂洗，然后加入PBS稀釋的辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(稀釋比例1:20000 )，室溫反應(yīng)1 h后漂洗，化學(xué)發(fā)光底物顯色，成像。通過計(jì)算與內(nèi)參蛋白(GAPDH)比值確定目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL法檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡率 結(jié)果顯示，control group細(xì)胞核藍(lán)染，少見凋亡細(xì)胞，而在Dex 1、10、100 μmol/L組中可見大量細(xì)胞核被染成棕褐色的凋亡細(xì)胞，且隨Dex干預(yù)濃度的增加成骨細(xì)胞凋亡率顯著性升高[Dex 1 μmol/L(14.2±1.8)%、10 μmol/L(22.8±2.7)%、Dex 100 μmol/L(29.5±3.8)%]，在Dex 100 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值(F(3,28)=159.0，P=0.000)。各實(shí)驗(yàn)組與control group[(3.7±0.5)%]相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 (n=8,×400)*P<0.05，**P<0.01，與control group比較Fig.1 Detect the apoptosis rate by the TUNEL way(n=8,×400)*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

2.2 JC-1染色后檢測(cè)線粒體跨膜電位 結(jié)果顯示，隨Dex干預(yù)濃度的增加JC-1陽(yáng)性細(xì)胞率顯著性升高[1 μmol/L(12.5±1.1)%、10 μmol/L(18.7±1.2)%、100 μmol/L(27.2±1.7)%]，線粒體跨膜電位降低，在100 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值(F(3,28)=499.5，P=0.000)。各實(shí)驗(yàn)組與control group[(4.5±0.7)%]相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 JC-1染色檢測(cè)線粒體跨膜電位結(jié)果(n=8)*P<0.05，**P<0.01，與control group比較Fig.2 Results of mitochondrial transmembrane electric potential after JC-1 staining(n=8)*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

2.3 Western blot檢測(cè)線粒體內(nèi)Bax、Bcl-2表達(dá) 線粒體蛋白分離提取后行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示隨Dex干預(yù)濃度的增加線粒體內(nèi)Bax表達(dá)顯著性上調(diào)[1 μmol/L(0.28±0.05)、10 μmol/L(0.37±0.08)、100 μmol/L(0.43±0.11)]，在100 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值(F(3,28)=17.4，P=0.000)。各實(shí)驗(yàn)組與control group[(0.18±0.04)]相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)。各組線粒體內(nèi)Bcl-2表達(dá)無顯著性差異[control group (0.48±0.09)、1 μmol/L(0.51±0.12)、10 μmol/L(0.44±0.11)、100 μmol/L(0.46±0.11)] (F(3,28)=0.62，P=0.607)。

圖3 Westen blot檢測(cè)線粒體內(nèi)Bax、Bcl-2表達(dá)情況(n=8)*P<0.05，**P<0.01，與control group比較Fig.3 Expression of Bax and Bcl-2 in the mitochondria by Western blot(n=8)*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

2.4 Western blot檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C、AIF表達(dá) 胞質(zhì)蛋白分離提取后行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示隨Dex干預(yù)濃度的增加胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C[control group (0.16±0.03)、1 μmol/L(0.34±0.08)、10 μmol/L(0.45±0.13)、100 μmol/L(0.58±0.15)] (F(3,28)=22.4，P=0.000)、AIF[control group (0.15±0.03)、1 μmol/L(0.36±0.09)、10 μmol/L(0.58±0.16)、100 μmol/L(0.78±0.15)] (F(3,28)=42.61，P=0.000)表達(dá)均顯著性上調(diào)，在100 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值。各實(shí)驗(yàn)組與control group比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)。

圖4 Western blot檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C、AIF表達(dá)情況(n=8)*P<0.05，**P<0.01，與control group比較Fig.4 Expression of Cyt-C,AIF in the cytoplasm by Western blot(n=8)*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

3 討論

以往研究表明，大劑量糖皮質(zhì)激素可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，且隨著劑量增加細(xì)胞凋亡率逐漸升高[3]，這一論斷在本研究中得到了驗(yàn)證，但具體的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前仍不明確。因此本研究通過檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體跨膜電位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)及線粒體相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討激素誘發(fā)成骨細(xì)胞凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制。

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeabimity transitionproe，MPTP) 是定位于線粒體內(nèi)、外膜之間由多種蛋白組成的非選擇性復(fù)合通道，是線粒體內(nèi)外信息的交流中樞，其開放狀態(tài)決定著線粒體的功能發(fā)揮，在生理情況下的周期性開放對(duì)維持ΔΨm及線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要作用。在各種凋亡信號(hào)刺激下MPTP不可逆的過度開放，將導(dǎo)致ΔΨm下降甚至消失，呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓增高，促凋亡活性物質(zhì)釋放入胞質(zhì)，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[8]。通過檢測(cè)ΔΨm可直觀地反映MPTP的開放狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Dex干預(yù)濃度的增加，JC-1陽(yáng)性細(xì)胞率顯著性升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這一結(jié)果說明Dex干預(yù)濃度的增加促進(jìn)了MPTP過度開放，使△Ψm降低，Dex可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

由于以往研究表明，MPTP過度開放是通過Bcl-2家族抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)的[9-11]，因此選擇Bcl-2家族中具有代表性的2個(gè)蛋白Bax、Bcl-2，通過對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與定位研究進(jìn)一步探討Dex對(duì) MPTP的調(diào)控機(jī)制。Bax與Bcl-2是一對(duì)研究較明確、作用完全相反的線粒體相關(guān)凋亡蛋白，2者比值決定細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)。Bax正常定位于胞質(zhì)內(nèi)，在凋亡信號(hào)的刺激下可由細(xì)胞質(zhì)易位到線粒體外膜，構(gòu)成跨線粒體外膜的孔增加膜通透性，導(dǎo)致ΔΨm降低和Cyt-C及AIF的外流[12-13]。Bcl-2在正常細(xì)胞內(nèi)定位于線粒體外膜，具有穩(wěn)定線粒體膜的功能,可以封閉Bax形成孔道的活性，不斷地將易位至線粒體的Bax重新移回細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而阻止線粒體外膜透化[14]。Cyt-C與AIF均錨定于線粒體內(nèi)膜，當(dāng)MPTP過度開放時(shí)其由線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，可通過caspase依賴/非依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，隨Dex干預(yù)濃度的增加，線粒體內(nèi)Bax及胞質(zhì)內(nèi)Cyt-C、AIF表達(dá)均顯著性上調(diào)(P<0.05)，而線粒體內(nèi)BCL-2無明顯變化，這一結(jié)果提示Dex是通過促使Bax由胞質(zhì)易位至線粒體，使線粒體內(nèi)Bcl-2/Bax比值降低，導(dǎo)致線粒體膜透化、MPTP過度開放，從而促進(jìn)了Cyt-C、AIF等凋亡活性物質(zhì)外流進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。這可能是Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

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(編校：王儼儼)

Glucocorticoid induced apoptosis in osteoblast via a mitochondria-mediated pathway

ZHAO Shuo，LI ChengΔ

(Quality Control Office,The Frist Hospital of Liaoning Medical Colleage, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo explore the molecular mechanism of osteoblast apoptosis mediated by glucocorticoid, provide experimental basis for clinical prevention and treatment of hormonal necrosis of femoral-head.MethodsThe MC3T3-E1 cells were divided into control group and three treatment group treated with different concentrations of dexamethasone (1, 10, 100 μmol/L) for 24 hours.The apoptosis rate detected by TUNEL, the mitochondrial transmembrane electric potential after JC-1 staining by flow cytometry, the expression of Bax, Bcl-2 in mitochondrion and Cyt-C, apoptosis inducing factor (AIF) in cytoplasm by Western blot.ResultsWith the increasing of Dex concentration, the rate of osteoblast apoptosis was significantly increased(F(3,28)=159.0，P=0.000), the positive cell rate of JC-1 stainning was significantly increased(F(3,28)=499.5，P=0.000), the expression of Bax(F(3,28)=17.4，P=0.000)in mitochondrion and Cyt-C(F(3,28)=22.4，P=0.000), AIF(F(3,28)=42.61，P=0.000)in cytoplasm were significantly increased.There were statistically significant difference of above indexes between control group and each experimental group(P<0.05).But there were no significant differences of Bcl-2 in mitochondrion among five groups(F(3,28)=0.62，P=0.607).ConclusionDexamethasone increases expression of Bax in mitochondrion, prompts mitochondrial permeability transition pore (MPTP) to be over-openning, induces apoptosis in osteoblast via a mitochondria- mediated pathway.

dexamethasone; osteoblasts; apoptosis

遼寧省自然科學(xué)基金(2013022061)

趙碩，女，碩士，主管護(hù)師，研究方向：骨壞死的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail:zhaoshuo1982@126.com；李成，通訊作者，男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，研究方向：骨壞死的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail:lichen19780101@163.com。

R681.1

A

1005-1678(2015)07-0035-04