四種中藥材DNA提取方法的比較

張馨元，趙超越，侯和勝，佟少明

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/遼寧省植物生物工程重點實驗室，遼寧 大連 116081)

?

四種中藥材DNA提取方法的比較

張馨元，趙超越，侯和勝Δ?，佟少明Δ?

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/遼寧省植物生物工程重點實驗室，遼寧 大連 116081)

目的 確定能夠滿足中藥材DNA條形碼研究的最適DNA提取方法。方法 以中藥材甘草、黃柏、管花肉蓯蓉和肉蓯蓉為實驗對象，采用改良高鹽低pH法、改良SDS法、CTAB法、PVP法、PlantZol試劑盒及Ezup柱式試劑盒6種DNA提取方法進行DNA提取，采用紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳和ITS2與psbA-trnH序列的引物PCR擴增對DNA產(chǎn)量及質(zhì)量進行檢測。結(jié)果 改良高鹽低pH法和Ezup柱式試劑盒提取的4種中藥材的DNA質(zhì)量相對較好，其OD260/OD280的值在1.7～1.9之間，PlantZol試劑盒法所提取的DNA得率相對較高，其次為改良高鹽低pH法(P<0.05)，但PlantZol試劑盒所提取DNA的純度較差，DNA電泳檢測表明改良高鹽低pH法、改良SDS法、CTAB法和PlantZol試劑盒所提取到甘草和管花肉蓯蓉的DNA完整性較好，而6種方法所提取的黃柏與肉蓯蓉的DNA則均在泳道內(nèi)呈彌散狀態(tài)，但只有改良高鹽低pH法其ITS2和psbA-trnH序列的引物PCR擴增成功率為100%。結(jié)論 改良高鹽低pH值法提取的基因組DNA可以用來中藥DNA條形碼的建立，且該方法具有成本低、步驟簡單、時間短等優(yōu)點，是一種高效、快速、經(jīng)濟的中藥材基因組DNA提取方法。

DNA條形碼；DNA提??；甘草；黃柏；管花肉蓯蓉；肉蓯蓉

我國是藥用植物資源多樣性最豐富的國家，野生中藥材是中華民族的瑰寶。近年來隨著對外合作交流研究領(lǐng)域日益擴大，藥材市場上存在大量不同替代品混用，不同地區(qū)同名異物入藥，緊俏藥材使用其近緣植物入藥的現(xiàn)象[1]。DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)是利用標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)，它可以實現(xiàn)對物種進行快速的自動鑒定[2]，是近年來生物分類和鑒定的研究熱點，在物種鑒定方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景[3-5]。2009 年，陳士林等[6-7]通過對6000余份藥用植物樣本進行DNA條形碼序列篩選，表明ITS2序列的鑒定能力優(yōu)于國際條形碼協(xié)會植物工作組推薦的rbcL+matK組合，首次提出將ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用DNA條形碼，并建立了以ITS2為核心，psbA-trnH為補充序列的藥用植物條形碼鑒定體系。DNA提取是開展中藥材DNA條形碼研究的首要環(huán)節(jié)，已有的中藥DNA條形碼研究中多從硅膠干燥的葉片或其他新鮮組織中提取DNA、擴增、測序后獲得目標片段以區(qū)分物種[8-10]，但市售中藥材大多為干品，而中藥材的加工炮制和貯藏的整個過程，如日曬、高溫烘干等都會使基因組DNA降解。本研究對6種DNA提取方法進行比較，篩選出適合中藥材DNA條形碼分析的通用DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料 皮類中藥材黃柏(P.ChinensisCortex)，中藥材甘草(G.uralensisFisch)，莖類中藥材肉蓯蓉(C.deserticolaMa)，莖類中藥材管花肉蓯蓉(C.tubulosaWight)。

1.2 DNA提取 分別采用6種不同的DNA提取方法，對4種中藥材進行了DNA提取。各實驗重復(fù)3次。

1.2.1 改良高鹽低pH法：本方法參照羅焜等[11]的方法，做適當改動。具體操作如下：取藥材適量，去除表面污染，用刀片將其切成細小薄片于預(yù)冷研缽中，加液氮迅速研磨至粉末狀，取0.1 g轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中。加1 mL高鹽低pH提取緩沖液[1.4%(w/v)SDS，100 mM KAc(pH 4.8)，50 mM EDTA (pH8.0)，0.5 M NaCl，2%(w/v)PVP， pH5.5]，65 ℃水浴40 min(其間顛倒混勻3～4次)；10000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)入新管，加2/3體積的2.5 M KAc(pH4.8)，4 ℃冰箱放置15 min；取上清液轉(zhuǎn)入新管，加等體積酚-氯仿-異戊醇(25︰24 ︰1)，顛倒混勻；10000 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)入新管，加0.7體積預(yù)冷異丙醇，4 ℃冰箱放置1 h；10000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇清洗2次；10000 r/min離心5 min，棄乙醇，沉淀室溫自然干燥后，加30 μL TE或dH2O定容，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 改良SDS法：本方法參照陳莉等[12]的方法，做適當改動。具體操作如下：取藥材適量，去除表面污染，用刀片將其切成細小薄片于預(yù)冷研缽中，加液氮迅速研磨至粉末狀，取0.1 g轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，加入900 μL SDS提取緩沖液[100 mM Tris-HC1(pH 8.0)，50 mM EDTA，0.5 M NaC1，2%(w/v)PVP，用前加β-巰基乙醇至終濃度為2%]，混勻后加入350 μL 10%(w/v)SDS，65 ℃水浴10～15 min(其間顛倒混勻2～3次)；加入400 μL 5 mol/L KAc,混勻后冰浴30 min；10000 r/min離心15 min；取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24︰1)，充分混勻；8000 r/min離心10 min，重復(fù)離心1次；取上清，加入2/3體積預(yù)冷異丙醇，-20 ℃放置30 min。8000 r/min離心10 min；70%乙醇洗滌沉淀2次，沉淀室溫自然干燥后，加30 μL TE或dH2O定容，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CTAB法：本方法參照段中崗等[13]的方法，做適當改動。具體操作如下：取藥材適量，去除表面污染，用刀片切成細小薄片于預(yù)冷研缽中，加液氮迅速研磨至粉末狀，取0.1 g轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，加800 μL 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液[3%(w/v)CTAB,100 mM Tris-HC1(pH 8.0),20 mM EDTA,1.4 M NaC1,1%(w/v)PVP,用前加β-巰基乙醇至終濃度為0.2%]，65 ℃水浴40 min(其間顛倒混勻3～4次)；冷卻至室溫，加等體積酚-氯仿-異戊醇(25︰24︰1)，輕緩顛倒混勻；10000 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)入新管，加等體積酚-氯仿-異戊醇(25︰24︰1)，輕緩顛倒混勻；10000 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)入新管，加0.7體積預(yù)冷異丙醇，4 ℃冰箱放置1 h；10000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇清洗2次；10000 r/min離心5 min，棄乙醇，沉淀室溫自然干燥后，加30 μL TE或dH2O定容，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PVP法：本方法參照馬文麗等[14]的方法，做適當改動。具體操作如下：取藥材適量，去除表面污染，用刀片切成細小薄片于預(yù)冷研缽中，加液氮迅速研磨至粉末狀，取0.1 g轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中。加1 mL PVP提取緩沖液[200 mM Tris-HC1(pH 8.0)，25 mM EDTA，250 mM NaCl，50 g/L SDS，pH8.0]，65 ℃水浴30 min(其間顛倒混勻2～3次)；加入20 mg PVP粉末和0.5體積的乙酸銨溶液(7.5 M)，混合均勻，-20 ℃放置20 min；10000 r/min離心10 min，取上清液于新管，加0.6體積預(yù)冷異丙醇，-20 ℃放置沉淀20 min；12000 r/min離心2 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇清洗2次；沉淀室溫自然干燥后，加30 μL TE或dH2O定容，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PlantZol試劑盒法：PlantZol試劑盒購置于北京全式金生物技術(shù)有限公司，DNA提取操作過程完全參照說明書進行。

1.2.6 Ezup柱式試劑盒法：Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(植物)購置于上海生工生物工程有限公司，DNA提取操作過程完全參照說明書進行。

1.3 DNA品質(zhì)的檢測

1.3.1 純度和濃度檢測：將所得DNA提取液稀釋10倍后，用紫外/可見分光光度計，測定OD260及OD280的吸收值，以確定所提取DNA的純度和濃度。

DNA濃度計算公式：DNA濃度(μg/μL)=OD260×0.05×稀釋倍數(shù)

DNA得率計算公式：DNA得率(μg/g)=(DNA濃度×V原液)/m材料

1.3.2 電泳檢測：取5 μL提取的DNA溶液上樣進行電泳檢測，電泳條件為1×TBE電泳緩沖液，0.7%瓊脂糖凝膠，溴化乙錠染色后，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.3 PCR擴增檢測：分別以提取的4種中藥材的DNA為模板，采用通用引物ITS2和psbA-trnH進行PCR擴增[9,15]，引物序列為ITS2-F：5’-GCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS2-R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；psbA-trnH-F：5’-GTTATGCAT-GAACGTAATGCTC-3’，psbA-trnH-R：5’-CGCGCATGGTGGAT-TCACAATCC-3’；反應(yīng)體系為10 μL，其中：10×擴增緩沖液1 μL，dNTP混合物(各10 mmol/L)0.8 μL，上下游引物(10 mmol/L)各0.2 μL,模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶(2 U/μL)0.1 μL，加雙蒸水至10 μL。

2 結(jié)果

2.1 中藥材甘草純度、濃度和得率 對于中藥材甘草，改良高鹽低pH法、CTAB法和Ezup柱式試劑盒所提取到的DNA，其A260/A280均在1.7～1.9之間，表明得到的DNA質(zhì)量較好，而PVP法與改良SDS法所提取到的DNA，其A260/A280小于1.7，表明得到的DNA中存在有蛋白質(zhì)、多糖和酚類等物質(zhì)的污染；PlantZol試劑盒提取到的DNA，其A260/A280大于1.9，說明得到的DNA中存在RNA的污染，見表1。

對于6種提取方法所提取的中藥材甘草的DNA的得率進行方差分析，得到F值為175.659，P值為0.000。結(jié)果表明，PlantZol試劑盒與其他5種方法比較，得率顯著高于其他5組(P<0.05)；改良高鹽低pH法、改良SDS法和CTAB法，其得率間相比較，無統(tǒng)計學(xué)意義；這3種方法的得率顯著高于PVP法和Ezup柱式試劑盒法(P<0.05)。綜合考慮得率較高的4種方法，改良高鹽低pH法與CTAB法為提取甘草總DNA的最佳方法。

表1 6種方法提取4種中藥材總DNA的紫外吸收和得率±s)Tab.1 Ultraviolet absorption and yield of total DNA extracted from four kinds of Chinese traditional medical herbs by using six kinds of ±s)

*P<0.05，與改良高鹽低pH法相比較，compared with modified high salt and low pH method;#P<0.05，與改良SDS法相比較，compared with modified SDS method；△P<0.05，與CTAB法相比較，compared with CTAB method；▽P<0.05，與PVP法相比較，compared with PVP method；▲P<0.05，與PlantZol試劑盒相比較，compraed with PlantZol kit

2.2 中藥材黃柏純度、濃度和得率 中藥材黃柏，改良高鹽低pH法和Ezup柱式試劑盒所提取到的DNA，其A260/A280均在1.7～1.9之間，表明得到的DNA質(zhì)量較好，而其他4種方法所提取到的DNA，其A260/A280均小于1.7，表明得到的DNA中存在有蛋白質(zhì)、多糖和酚類等物質(zhì)的污染，見表1。

對于6種提取方法所提取的中藥材黃柏的DNA的得率進行方差分析，得到F值為20.639，P值為0.000。結(jié)果表明，得率較高的改良高鹽低pH法與PlantZol試劑盒2者之間無統(tǒng)計學(xué)意義；這2種方法分別與其他4種方法的得率相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但PlantZol試劑盒所提取黃柏DNA的純度較差，其A260/A280為1.26，因此改良高鹽低pH法為提取黃柏總DNA的最佳方法。

2.3 中藥材管花肉蓯蓉純度、濃度和得率 中藥材管花肉蓯蓉，改良高鹽低pH法、PlantZol試劑盒和Ezup柱式試劑盒所提取到的DNA，其A260/A280均在1.7～1.9之間，表明得到的DNA質(zhì)量較好，而改良SDS法和PVP法所提取到的DNA，其A260/A280均小于1.6，表明得到的DNA中存在有蛋白質(zhì)、多糖和酚類等物質(zhì)的污染，CTAB法提取到的DNA，其A260/A280大于1.9，說明得到的DNA中存在RNA的污染，見表1。

對于6種提取方法所提取的中藥材管花肉蓯蓉的DNA的得率進行方差分析，得到F值為200.702，P值為0.000(P<0.05)。結(jié)果表明，改良高鹽低pH法的得率顯著高于其他5種方法的得率(P<0.05) ，因此改良高鹽低pH法為提取管花肉蓯蓉總DNA的最佳方法。

2.4 中藥材肉蓯蓉純度、濃度和得率 對于中藥材肉蓯蓉，改良高鹽低pH法和Ezup柱式試劑盒所提取到的DNA，其A260/A280均在1.7～1.9之間，表明得到的DNA質(zhì)量較好，而改良SDS法、CTAB法和PVP法所提取到的DNA，其A260/A280均小于1.6，表明得到的DNA中存在有蛋白質(zhì)、多糖和酚類等物質(zhì)的污染，PlantZol試劑盒提取到的DNA，其A260/A280大于1.9，說明得到的DNA中存在RNA的污染。

對于6種提取方法所提取的中藥材肉蓯蓉的DNA的得率進行方差分析，得到F值為35.369，P值為0.000。結(jié)果表明， PlantZol試劑盒的得率顯著高于其他5種方法(P<0.05)；改良高鹽低pH法與CTAB法的得率相比較，無統(tǒng)計學(xué)意義；其得率與改良SDS法、PVP法和Ezup柱式試劑盒法兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ，但PlantZol試劑盒所提取到肉蓯蓉DNA的純度較差，因此改良高鹽低pH法為提取肉蓯蓉總DNA的最佳方法。見表1。

2.5 DNA電泳檢測 觀察6種提取方法所提取到的4種中藥材DNA電泳圖，發(fā)現(xiàn)4種中藥材均存在不同程度的降解，其中改良高鹽低pH法(見圖1-A)、改良SDS法(見圖1-B)、CTAB法(見圖1-C)和PlantZol試劑盒(見圖1-E)所提取到甘草和管花肉蓯蓉的DNA可以觀察到較為清晰的主帶，其中圖1-E所提取到甘草和管花肉蓯蓉的DNA條帶更加清晰，表明PlantZol試劑盒所提取的DNA完整性較好。而圖1-A所提取到甘草和管花肉蓯蓉的DNA拖尾現(xiàn)象較輕，說明高鹽低PH法在提取過程中對雜質(zhì)的去除效果較好。這6種方法所提取到的肉蓯蓉的DNA在整條泳道中呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，其原因應(yīng)是大量DNA已經(jīng)降解成小片段DNA。而對于黃柏總DNA的提取，在泳道內(nèi)幾乎看不到彌散狀的DNA，說明其DNA已嚴重降解。

圖1 6種DNA提取方法所提取的4種中藥材的DNA電泳圖M.λ-Hind III digest DNA Marker；1.甘草；2.管花肉蓯蓉；3.肉蓯蓉；4.黃柏A.改良高鹽低pH法；B.改良SDS法；C.CTAB法；D.PVP法；E.PlantZol試劑盒；F.Ezup柱式試劑盒Fig.1 Total DNA electrophoresis of four kinds of Chinese traditional medical herbs by using six DNA extraction methodsM.λ-Hind III digest DNA Marker; 1.Glycyrrhiza uralensis Fisch; 2.Cistanche tubulosa Wight; 3.Cistanche deserticola Ma； 4.Phellodendron Chinensis CortexA.improved high-salt combined low-pH method; B.improved SDS method; C.CTAB method; D.PVP method; E.PlantZol kit; F.Ezup kit

2.6 PCR擴增 使用候選條形碼基因ITS2和psbA-trnH的通用引物對6種方法所提取到的DNA樣品進行擴增，觀察電泳圖發(fā)現(xiàn)，通過改良高鹽低pH法(見圖2-A)所提取的DNA可以成功擴增出ITS2與psbA-trnH譜帶，其中黃柏和肉蓯蓉雖然在DNA電泳檢測結(jié)果中條帶模糊不清，但其PCR擴增結(jié)果依然清晰明亮，說明在中藥材DNA提取過程中，DNA電泳檢測結(jié)果不能直接影響PCR擴增結(jié)果。其他5種方法均未能100%擴增出譜帶，其中中藥材黃柏PCR擴增成功率最低，可能是提取的DNA中所含的雜質(zhì)影響了Taq酶的活性。通過PVP法(見圖2-D)所提取到的DNA只擴增出了管花肉蓯蓉的ITS2與psbA-trnH的譜帶，說明PVP法提取的DNA無法滿足后續(xù)實驗要求。

圖2 6種DNA提取方法所提取4種中藥材DNA的ITS2與psbA-trnH引物PCR擴增電泳圖A.改良高鹽低pH法；B.改良SDS法；C.CTAB法；D.PVP法 E.PlantZol試劑盒；F.Ezup柱式試劑盒M.DL2000 DNA Marker；ITS2；1甘草；2管花肉蓯蓉；3肉蓯蓉；4黃柏；psbA-trnH:5甘草；6管花肉蓯蓉；7肉蓯蓉；8黃柏Fig.2 Electrophoresis result of ITS2 and psbA-trnH primer PCR amplified with the total DNA extracted from four kinds of Chinese traditional medical herbs with six DNA extraction methodsA.improved high-salt low-pH method; B.improved SDS method; C.CTAB method; D.PVP method; E.PlantZo kit; F.Ezup kit；M:DL2000 DNA MarkerITS2:1 Glycyrrhiza uralensis Fisch; 2 Cistanche tubulosa Wight; 3 Cistanche deserticola Ma; 4 Phellodendron Chinensis Cortex；psbA-trnH:5 Glycyrrhiza uralensis Fisch; 6 Cistanche tubulosa Wight; 7 Cistanche deserticola Ma; 8 Phellodendron Chinensis Cortex

3 討論

DNA條形碼技術(shù)是近年來的一種新興技術(shù)，該技術(shù)不受物種發(fā)育階段和形態(tài)的限制，鑒定速度快，準確性高、獲取信息量大，通用性強，使用方便。因此DNA barcoding技術(shù)將是今后生物物種鑒定發(fā)展的主要方向之一。中藥DNA條形碼鑒定工作流程包括：中藥DNA提取、PCR 擴增與測序、條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建以及基于數(shù)據(jù)庫比對鑒定物種，從中藥材中獲得高質(zhì)量DNA是該流程的第一步也是進行后續(xù)條形碼數(shù)據(jù)庫建立的關(guān)鍵。本研究采用改良的高鹽低pH值法從4種中藥材中提取基因組DNA，并與改良SDS法和改良CTAB法等6種提取DNA的方法效果進行比較，結(jié)果表明在DNA提取過程中，PlantZol試劑盒所提取到甘草和管花肉蓯蓉的DNA要比改良高鹽低pH值法所提取到的DNA電泳條帶更加清晰，但改良高鹽低pH值法所提取的DNA其ITS2與psbA-trnH的PCR擴增成功率為100%要高于PlantZol試劑盒的PCR擴增成功率，可能是PlantZol試劑盒中試劑的成分對于像中藥材這種富含多糖和多酚等次生代謝物質(zhì)的去除不充分，致使對后續(xù)實驗造成影響。

與新鮮組織不同，中藥材的干燥過程緩慢，儲存時間長，加工步驟繁多，使DNA降解嚴重，DNA含量降低。由于中藥材中次生代謝產(chǎn)物含量高，尤其是中藥材組織含有較多的多糖及酚類、酯類、萜類等次生代謝產(chǎn)物，會嚴重干擾DNA的提取。改良高鹽低pH法的關(guān)鍵是采用低pH提取介質(zhì)，能有效地防止組織破碎及沉淀時的電離化作用和酚類化合物的進一步氧化。本研究將0.1 g中藥材與1 mL高鹽低pH提取液混合，抽提比較充分，但是對于像黃柏這種極其富含多糖多酚的皮類中藥材，與提取液混合后呈現(xiàn)出非常粘稠的膠質(zhì)狀態(tài)，因此可以增加提取液至2 mL使抽提更加充分。PVP可以有效去除中藥材中富含的多糖，本實驗研究證實PVP含量以2%為宜。低pH的醋酸鉀溶液是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑,再加之酚-氯仿-異戊醇分層反復(fù)抽提使蛋白質(zhì)的去除更加充分。

對提取的中藥材DNA進行PCR凝膠電泳條帶檢測時，各種方法所提取的黃柏和肉蓯蓉的DNA都看不到主帶，大都在整條泳道中呈彌散狀，有時甚至彌散的DNA泳帶也看不見，其主要原因是本研究所用的中藥材黃柏和肉蓯蓉已經(jīng)過“清水漂7天，取出濾干水分，切1分厚橫片，曬干”等復(fù)雜的炮制過程，其DNA已嚴重降解。但在后續(xù)的PCR擴增時，只有改良高鹽低pH法提取到的DNA樣品可以100%得到PCR擴增產(chǎn)物，其他方法未能全部成功的獲得PCR擴增產(chǎn)物，可能是提取的DNA中所含的雜質(zhì)對Taq酶的活性影響較大，而無法擴增出條帶。對于本文所研究的4種藥材而言，改良高鹽低pH法與其他方法相比具有DNA純度和得率較高，能夠滿足后續(xù)試驗要求等優(yōu)點。對于本文未考察的葉、花、果以及動物材質(zhì)等類型中藥材，改良高鹽低pH法是否優(yōu)于其它方法有待進一步研究驗證。

[1] 陳士林，蘇鋼強，鄒健強，等.中國中藥資源可持續(xù)發(fā)展體系構(gòu)建[J].中國中藥雜志，2005，39(15)：1141-1146.

[2] 肖金花，肖暉，黃戴維.生物分類學(xué)的新動向：DNA條形編碼[N].動物學(xué)報，2004，50(5)：852-855.

[3] 陳士林，姚輝，宋經(jīng)元，等.基于DNA barcoding(條形碼)技術(shù)的中藥材鑒定[J].世界科學(xué)技術(shù)，2007，9(3)：7-12.

[4] Li DZ,Liu JQ,Chen ZD,et al.Plant DNA barcoding in China[J].J Syst Evol,2011,49:165-168.

[5] Li M,Cao H,But PPH，et al.Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes[J].J Syst Evol,2011,49(3):271-283.

[6] CBOL Plant Working Group.A DNA barcode for land plants[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2009,106(31):12794-12797.

[7] Chen SL,Yao H,Han JP,et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS ONE,2010,5(1):e8613.

[8] Yao H,Song JY,Ma XY,et al.Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psbA -trnH intergenic region[J].Planta Med,2009, 75(6):667-669.

[9] 羅焜，陳士林，陳科力，等.基于蕓香科的植物通用DNA條形碼研究[J].中國科學(xué)，2010，30(4)：342-351.

[10] 朱英杰，陳士林，宋經(jīng)元，等.重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2010，45(3)：376-382.

[11] 羅焜，馬培，姚輝，等.中藥DNA條形碼鑒定中的DNA提取方法研究[J].世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化)，2012，14(2)：1433-1439.

[12] 陳莉，魏莉，周童，等.幾種中藥DNA提取方法的比較研究[J].廣西植物，2007，27(1)：137-139.

[13] 段中崗，黃瓊林，楊錦芬，等.適合中藥材DNA條形碼分析的DNA提取方法的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2009，20(5)：480-484.

[14] 馬文麗，石嶸.核酸提取與純化實驗指南[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012：52.

[15] 寧淑萍，顏海飛，郝剛，等.植物DNA條形碼研究進展[J].生物多樣性，2008，16(5)：417-425.

(編校：王冬梅)

Comparison of DNA extraction methods from four Chinese traditional medical herbs

ZHANG Xin-yuan, ZHAO Chao-yue, HOU He-shengΔ?, TONG Shao-mingΔ?

(Key Laboratory of Plant Biological Engineering in Liaoning Province, College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo establish an optimum DNA extraction method for Chinese traditional medical herbs in order to meet necessary for DNA barcoding research.MethodsFour Chinese traditional herbs,GlycyrrhizauralensisFisch,PhellodendronChinensisCortex,CistanchetubulosaWight andCistanchedeserticolaMa were chosen as the experimental materials, the DNA was extracted by 6 different kinds of DNA extraction method, including the improved method of high-salt combined low-pH,the improved method of SDS,CTAB method,PVP method,PlantZol Kit and Ezup Kit, the quality of DNA was investigated by ultraviolet spectrophotometry，agarose gel electrophoresis and PCR amplification by using specific primers of ITS2 andpsbA-trnH.ResultsThe quality of the DNA was better than other four kinds of methods by the improved method of high-salt combined low-pH and Ezup Kit, the value of OD260/OD280was between 1.7～1.9,the yield of DNA was the highest by the PlantZol kit , followed by the improved method of high-salt combined low-pH(P<0.05),but the purity of DNA was poor by the PlantZol kit.The DNA electrophoresis tests showed that the DNA integrity ofGlycyrrhizauralensisFisch andCistanchetubulosaWight were better with the improved method of high-salt combined low-pH, the improved SDS method, the CTAB method and the PlantZol kit.The DNA ofPhellodendronChinensisCortex andCistanchedeserticolaMa were extracted by the six methods appeared diffuse status in the lanes.But only the improved method of high-salt combined low-pH could make the PCR amplification of the success rate 100% by using specific primers of ITS2 and trnH-psbA.ConclusionThe DNA extraction method of high-salt combined low-pH can be used to establish the Chinese DNA barcoding which has the advantages of lower cost, simpler procedure and less time.

DNA barcoding; DNA extraction;GlycyrrhizauralensisFisch;PhellodendronChinensisCortex;Cistanchetubulosawight;CistanchedeserticolaMa

張馨元，女，碩士在讀，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail: 1172481464@qq.com；侯和勝，通訊作者，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail：hesheng_hou@126.com；佟少明，共同通訊作者，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail：tongsm@163.com。

Q523+.8

A

1005-1678(2015)07-0017-05