遵義地區(qū)多發(fā)性硬化患者血清BDV-CIC及抗體的檢測

劉海軍，鄔小燕，田永攀，徐平Δ

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 新生兒科，貴州 遵義 563000)

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遵義地區(qū)多發(fā)性硬化患者血清BDV-CIC及抗體的檢測

劉海軍1，鄔小燕2，田永攀1，徐平1Δ

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 新生兒科，貴州 遵義 563000)

目的 探討博爾納病病毒(Borna disease virus, BDV)感染與遵義地區(qū)多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)患者的相關(guān)性。方法 運(yùn)用新型的三聯(lián)ELISA測循環(huán)免疫復(fù)合物、抗體的方法，檢測7例MS患者及93例健康對(duì)照組血清中BDV特異性循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immune complex，CIC)及抗體。結(jié)果 7例MS中有2例CIC及抗體均為陽性，陽性率為28.57%(2/7)；93例對(duì)照組中CIC陽性7人，陽性率為7.53%(7/93)，抗體陽性5例，陽性率為5.38%(5/93)；多發(fā)性硬化組檢出率高于健康對(duì)照對(duì)照組，但2組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 遵義地區(qū)存在著BDV的感染，BDV感染與多發(fā)性硬化不一定相關(guān)。

博爾納病病毒；循環(huán)免疫復(fù)合物；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；多發(fā)性硬化

博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)感染的血清學(xué)和流行病學(xué)顯示，BDV感染的宿主很廣泛，可以感染多種脊椎動(dòng)物，并且可能是人類某些神經(jīng)疾病的誘因[1-4]。王長明[5]曾經(jīng)在13例多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中檢測BDV-p24基因片段，2例陽性。目前已經(jīng)建立各種檢測BDV的工具，但各實(shí)驗(yàn)室的研究數(shù)據(jù)報(bào)道差異較大，對(duì)于慢性持續(xù)感染的病毒來說檢測比較困難，分析主要原因可能為病毒在體內(nèi)低表達(dá)，抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，抗體與抗原結(jié)合形成循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immune complex，CIC)，而CIC一旦形成則長期存在機(jī)體內(nèi)，抗原抗體保持較低水平，免疫學(xué)檢查則結(jié)果常出現(xiàn)假陰性表達(dá)，因此目前尚無方法能夠早期快速、簡捷、有效的診斷 BDV 感染。近年來，大多數(shù)學(xué)者均采用Western blot及PCR檢測博爾納病病毒的抗體或者基因片段[6]，但上述對(duì)實(shí)驗(yàn)者技術(shù)要求高，耗時(shí)長，操作繁瑣，且檢測結(jié)果特異性不高，因此在對(duì)疾病早期診斷及使用在臨床中仍受限。而通過特異性CIC方法檢測BDV可充分檢測除顯性感染以外的BDV的感染各個(gè)時(shí)期情況，且該法穩(wěn)定、可信、敏感，是檢測感染活化唯一的方法，并可監(jiān)控整個(gè)感染過程。

本研究將采用三聯(lián)ELISA法對(duì)MS患者BDV感染后產(chǎn)生的病毒特異性抗體及循環(huán)免疫復(fù)合物進(jìn)行檢測，目前國內(nèi)尚未見報(bào)告，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取遵義市地區(qū)7例多發(fā)性硬化患者的血液(男性2例，女性5例)及體檢者外周血液樣本93例作為研究對(duì)象。BDV抗體和陽性(E4278)、陰性(LWJ)對(duì)照的樣本(由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心提供)，分別是抗P40的單克隆抗體Wl和抗P24的單克隆抗體Kfu2，BDV病毒液。

1.2 方法 分別采集患者外周血，離心后分離血漿備用。

1.2.1 血漿CIC的檢測：采用羊抗鼠IgG包被，上樣同時(shí)每個(gè)標(biāo)本均做一副孔，加入AP標(biāo)記的羊抗人IgG，后顯色劑混勻后顯色并加入終止液體終止反應(yīng)。

1.2.2 抗體的檢測：羊抗鼠IgG包被、洗板后加入W1、Kfu2、洗板后加入BDV病毒液、洗板后加入待檢血漿樣本，并設(shè)立空白對(duì)照、加入AP標(biāo)記的羊抗人IgG、加入顯色劑、加入終止液體終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)完畢后在415 nm時(shí)讀取A值，檢測標(biāo)準(zhǔn)：陰性<=0.1；臨界值>0.1～0.12；弱陽性(-+)>0.12～0.15；陽性(+)>0.15～0.3；中度陽性(++)>0.3～0.6；強(qiáng)陽性(+++)>0.6～1.0；極強(qiáng)陽性(++++)>1.0。并重復(fù)檢驗(yàn)2次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 血漿中BDV CIC及抗體的ELISA檢測結(jié)果

7例MS患者中有2例患者 CIC呈陽性，2例患者抗體呈陽性，2例患者CIC及抗體均為陽性；而對(duì)照組中共有7例患者 CIC呈陽性，5例患者抗體呈陽性，2項(xiàng)指標(biāo)均為陽性患者共5例。MS組BDV-CIC陽性和BDV抗體陽性檢出率分別為28.57%和28.57%，雙陽性率為100%。而對(duì)照組BDV-CIC陽性和BDV抗體陽性檢出率分別為7.53%和5.38%，雙陽性率為71.4%。MS組的雙陽性率略高于對(duì)照組，2者相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 多發(fā)性硬化組與健康對(duì)照組血漿中BDV-CIC及BDV抗體檢出率(%)Tab.1 Multiple sclerosis patients and healthy controls plasma BDV-CIC and BDV antibody detection rate(%)

3 討論

MS是一種由病毒、遺傳及環(huán)境等多種原因誘發(fā)的病變主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)白質(zhì)的與免疫介導(dǎo)相關(guān)的CNS炎性脫髓鞘性疾病。MS在臨床上多以廣泛脫髓鞘病變及少突膠質(zhì)細(xì)胞受損為主要表現(xiàn)。目前關(guān)于MS的發(fā)病機(jī)制尚在探討中，曾經(jīng)高度懷疑與一些病毒有關(guān)，如EB病毒、麻疹病毒等，但均未從腦組織分離到病毒。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病毒感染人體后，其可能存在與少突膠質(zhì)細(xì)胞或CNS髓鞘蛋白共同的抗原，導(dǎo)致T細(xì)胞激活，形成病毒抗體并與神經(jīng)髓鞘多肽片段交聯(lián)誘發(fā)脫髓鞘病變[7-8]。研究表明，多個(gè)亞型的T細(xì)胞在MS的發(fā)病過程及調(diào)控中發(fā)揮重要作用。其中包括CD4+Th1細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、NK T細(xì)胞、CD16+γδ T細(xì)胞、CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等[9]。Viglietta[10]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化(RRMS)患者的CD4+CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)數(shù)量與健康對(duì)照組相比，2者無差異，但功能卻明顯下降，因此認(rèn)為這可能為MS致病因素之一。德國Haas[11]證實(shí)上述論述，但進(jìn)一步指出Treg在腦脊液中CD4+T占有的比例與外周血之間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故而認(rèn)為外周血Treg功能降低與Treg進(jìn)入CNS發(fā)揮免疫抑制功能無關(guān)。在MS緩解期Treg依然是降低的，故推論MS患者Treg功能降低與該病是否活動(dòng)無關(guān)。CD8+T對(duì)于多發(fā)性硬化的致病也逐漸被認(rèn)識(shí)到，作為抗原識(shí)別的結(jié)果，CD8+T細(xì)胞可誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)溶解，還可調(diào)控多發(fā)性硬化患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)而參與疾病的發(fā)展。同時(shí)，Malmestr?m等[12]還在研究中指出，CSF/CNS中可能存在CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用并具有一定的特異性，這種特異性作用可能與RRMS病人復(fù)發(fā)有關(guān)并可能對(duì)恢復(fù)期病人產(chǎn)生持續(xù)幾個(gè)月的損害。

BDV可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)感染并導(dǎo)致博爾納病(BD)，即免疫介導(dǎo)的腦脊髓炎[13]。浸潤的免疫細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞為特征。CD8+T細(xì)胞代表對(duì)核蛋白呈抗原特異性的效應(yīng)細(xì)胞群[14]。Richt[15]將純化的BDV特異性抗原NP免疫大鼠，從其淋巴結(jié)獲取淋巴細(xì)胞，用于體外培養(yǎng)和接受再刺激，BDV接種大鼠后發(fā)現(xiàn)在灰質(zhì)、白質(zhì)出現(xiàn)了免疫介導(dǎo)的血管炎性反應(yīng)。分析這些細(xì)胞系揭示了BDV的特異性、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)II類抗原的限制性、以及CD4+輔助/炎癥細(xì)胞的表型標(biāo)志。Planz[16]用這些細(xì)胞系被動(dòng)轉(zhuǎn)移到BDV感染的環(huán)磷酰胺免疫抑制的大鼠，在注射后5 d可致共濟(jì)失調(diào)、麻痹等神經(jīng)癥狀，14～16 d出現(xiàn)典型BD表現(xiàn)；被動(dòng)轉(zhuǎn)移到非感染大鼠不引起腦炎或疾病，表明該BDV特異性T細(xì)胞系自身并不致腦炎。免疫組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)有BD癥狀大鼠一致表現(xiàn)腦炎病變中有CD8+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞均存在于病毒特異性CD4+T細(xì)胞系感染的大鼠腦中，這一點(diǎn)與是否有神經(jīng)癥狀無關(guān)。然而，用抗CD8+T細(xì)胞抗體處理的大鼠受者既不發(fā)生腦炎也無疾病癥狀。因此，CD4+T細(xì)胞在腦中積聚引起了血管周炎癥損害，但很明顯單獨(dú)并不致病。而CD8+T細(xì)胞的出現(xiàn)顯然與神經(jīng)癥狀發(fā)生直接相關(guān)。Bilzer[17]進(jìn)一步指出，在BDV感染的實(shí)驗(yàn)大鼠的腦實(shí)質(zhì)的神經(jīng)元內(nèi)檢測到CD8+T細(xì)胞、MHC I類抗原的表達(dá)。用單克隆抗體OX-8治療BDV感染的大鼠，發(fā)現(xiàn)它抑制CD8+細(xì)胞免疫病理反應(yīng)和降低的MHC I類抗原的表達(dá)。結(jié)果顯示CD8+T細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的存在和神經(jīng)元的MHC I類抗原對(duì)腦組織的免疫病理破壞和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用可以破壞BDV病毒對(duì)體內(nèi)神經(jīng)元的損傷。另外BDV感染大鼠腦組織分析發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞因子mRNA包括IL-6、TNF-α、IL-1、INF-γ、IL-2、 IL-4和IL-10水平增高。這些細(xì)胞因子mRNA在炎癥反應(yīng)高峰達(dá)最高水平，疾病慢性期明顯下降。Stitz[18]也證實(shí)BDV特異性的CD8+T細(xì)胞是效應(yīng)細(xì)胞群體的代表。。

BDV感染體內(nèi)可在CNS引起T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理反應(yīng)。MS致病過程為細(xì)胞免疫、體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子(Th1、Th2、Th17)等作用，從T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來分析2者有研究共同基礎(chǔ)。分子模擬學(xué)說中病毒為了躲避宿主機(jī)體的復(fù)雜的防御體系，病毒基因組可以通過編碼一些蛋白質(zhì)分子, 模擬細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的構(gòu)成元件或直接充當(dāng)信號(hào)過程中所需成分的封閉因子, 進(jìn)行對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)和調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn), 在BDV感染過程中BDV 蛋白可以通過分子模擬機(jī)制與機(jī)體相關(guān)蛋白(如高遷移率族蛋白、細(xì)胞周期蛋白以及熱休克蛋白等)結(jié)合，而參與BDV的感染與致病過程[19]。目前關(guān)于BDV是否與少突膠質(zhì)細(xì)胞或CNS髓鞘蛋白存在共同抗原及在受感染機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞激活并生成病毒抗體與神經(jīng)髓鞘多肽片段發(fā)生交叉反應(yīng)而導(dǎo)致脫髓鞘病變，尚未見報(bào)道。

本次研究的7例MS患者的臨床資料顯示為6例為復(fù)發(fā)-緩解型，1例為原發(fā)進(jìn)展型，其中7例MS患者中有2例患者 CIC呈陽性，2例患者抗體呈陽性，2例患者CIC及抗體均為陽性；而對(duì)照組中共有7例患者 CIC呈陽性，5例患者抗體呈陽性，2項(xiàng)指標(biāo)均為陽性患者共5例。MS組BDV-CIC陽性和BDV抗體陽性檢出率分別為28.57%和28.57%，雙陽性率為100%。而對(duì)照組BDV-CIC陽性和BDV抗體陽性檢出率分別為7.53%和5.38%，雙陽性率為71.4%。說明貴州省部分地區(qū)MS患者中存在 BDV感染。這一陽性率報(bào)道與本課題組王長明前期報(bào)道的15.38%(2/13)[5]，相差較大，這可能為2次樣本量均較少有關(guān)，郭霞[20]曾經(jīng)報(bào)道在6例MS患者CSF中檢測到2例患者的腦脊液中CIC為陽性，陽性率33.33%(2/6)相接近，同樣系樣本量較少所致。本研究中的2例檢測陽性的MS患者均不同程度存在精神異常，其中1例來自農(nóng)村(鳳岡縣)，無密切的動(dòng)物接觸史，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性肢體抖動(dòng)、無力、言語不清、吞咽困難及強(qiáng)哭強(qiáng)笑，并有癲癇發(fā)作，而另1例患者同樣有精神異常，主要為神志淡漠、懶言少語。BDV感染后產(chǎn)生的精神異常目前主要在動(dòng)物模型上被研究證實(shí)。Pletnikov[21]通過BDV感染大鼠后證實(shí)海馬、齒狀回顆粒細(xì)胞的持續(xù)退行性變，BDV的新發(fā)感染也顯示出與皮層的細(xì)化有關(guān)，這些結(jié)構(gòu)與精神行為異常均有明顯關(guān)聯(lián)。值得一提的是，即使檢測到抗體也不能證明BDV正處于感染中，因?yàn)橛锌赡芑颊咭呀?jīng)進(jìn)入了恢復(fù)期或者處于病毒攜帶狀態(tài)[22]。Bode[2]曾提出對(duì)于CIC 陽性的病人，需檢測其抗原、抗體，如抗原陽性提示急性期感染，應(yīng)給予抗病毒治療，如抗體陽性或者陰性也應(yīng)該進(jìn)行相關(guān)治療。本次樣本量分析由于本研究病例較少，又無流行病學(xué)資料，檢測的2例患者的精神異常及與BDV感染后的精神異常是否有關(guān)聯(lián)，抗病毒治療措施是否適用，需要在今后研究中擴(kuò)大樣本量，收集更多的臨床資料進(jìn)一步研究后證實(shí)。

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(編校：王冬梅)

Detection of the BDV specific CIC in plasma of patients with multiple sclerosis of Zunyi regions

LIU Hai-jun1, WU Xiao-yan2, TIAN Yong-pan1, XU Ping1Δ

(1.Department of Neurology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563000, China; 2.Department of Neonatology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China)

ObjectiveTo study the correlation with the infectious situation of Borna disease with the multiple sclerosisof Zunyi region.MethodsEstablished method of the specific CIC and an antibody of Borna were used to detect the PBMC of 7cases of patients with multiple sclerosis and 93 cases of control group.ResultsIn the collected 7 cases of PBMC in patients with multiple sclerosis, detected 2 positive samples of the specific CIC and antibody of Borna with a positive rate of 28.57%(2/7). Meanwhile, positive plasma samples were also detected in healthy control group, and the positive rate was 7.53%(7/93),The antibody positive rate of control group was also 5.38%(5/93). But between the two groups, the difference was no statistically significant.ConclusionResults indicate that the possibility of BDV infection is presented in Zunyi regions.BDV infection is not necessarily associated with multiple sclerosis.

BDV; CIC; ELISA; multiple sclerosis

國家自然科學(xué)基金(31160210)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字LKZ[2011]13號(hào))

劉海軍，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，E-mail：63258787@qq.com;徐平，通訊作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，E-mail：xuping527@vip.sina.com。

R751

A

1005-1678(2015)09-0064-03