131I-Herceptin聯(lián)合高能X線對(duì)HER2高表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷及機(jī)制研究

張迎，袁勝利，鄭勤，張全安，徐瀚峰

(1.南京市第二醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210003；2.山東省青島市市立醫(yī)院 腫瘤二科，山東 青島 266011)

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131I-Herceptin聯(lián)合高能X線對(duì)HER2高表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷及機(jī)制研究

張迎1，袁勝利2Δ，鄭勤1，張全安1，徐瀚峰1

(1.南京市第二醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210003；2.山東省青島市市立醫(yī)院 腫瘤二科，山東 青島 266011)

目的 研究131I-Herceptin聯(lián)合高能X線對(duì)HER2高表達(dá)人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的協(xié)同殺傷及機(jī)制。方法 運(yùn)用免疫組化法、熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)SK-BR-3細(xì)胞的人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增，采用Iodogen法制備131I-Herceptin，MTT法篩選131I-Herceptin殺傷SK-BR-3細(xì)胞的IC15濃度。根據(jù)是否應(yīng)用131I-Herceptin分為對(duì)照組及加藥組，分別給予高能X線(0、2、4、6 Gy)，以克隆形成試驗(yàn)分析協(xié)同殺傷效應(yīng)；將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、藥物組(131I-Herceptin)、高能X線組(2Gy)、聯(lián)合組(131I-Herceptin+2Gy)，以A0/EB法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及死亡率，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期。結(jié)果 SK-BR-3細(xì)胞為HER2高表達(dá)細(xì)胞。131I-Herceptin的標(biāo)記率為86.8%，放射化學(xué)純度為93.9%，放射性比活度為868.3 μci/mg。131I-Herceptin的IC15為15.625 μci/mL。發(fā)現(xiàn)131I-Herceptin(F=628.008，P<0.05)及高能X線(F=964.970，P<0.05)對(duì)SK-BR-3細(xì)胞均有顯著的殺傷作用，可明顯降低細(xì)胞的SF值，且2者具有交互作用(F=113.046，P<0.05)，即2者協(xié)同降低SF值。空白組、外照射組、藥物組及聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率與死亡率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.324，F(xiàn)=13.330，均P<0.05)，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)外照射及131I-Herceptin聯(lián)合作用后，細(xì)胞周期均發(fā)生明顯改變，由G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)移。結(jié)論131I-Herceptin 聯(lián)合高能X線對(duì)HER2高表達(dá)人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用。

乳腺癌；人表皮生長(zhǎng)因子受體2；放射免疫治療；協(xié)同殺傷

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor-2，HER2或 HER2/neu)在20%～30%的浸潤(rùn)性乳腺癌中過表達(dá)。HER2的過表達(dá)是判定乳腺癌惡性高及預(yù)后不良的金標(biāo)準(zhǔn)之一，且提高了腫瘤的放射抗拒性[1]。本實(shí)驗(yàn)將放射性核素131I與Herceptin連接，制備放射免疫藥物131I-Herceptin。已證實(shí)131I-Herceptin對(duì)HER2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的殺傷較131I、Herceptin均明顯增強(qiáng)[2]。而Herceptin可增加HER2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞對(duì)外照射的敏感性[1]。研究外照射與131I-Herceptin同時(shí)作用時(shí)是否具有協(xié)同殺傷作用，是進(jìn)一步增加治療效果的有效探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI-1640及胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品，Herceptin購(gòu)于上海羅氏公司，胎牛血清為Hyclon公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG及鼠抗人c-erbB-2單克隆抗體購(gòu)于中山金橋生物技術(shù)有限公司，膀胱癌細(xì)胞染色體及基因異常檢測(cè)試劑盒FISH購(gòu)于北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，Na131I為青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科惠贈(zèng)，Iodogen為Sigma公司產(chǎn)品，MTT為Amersco公司產(chǎn)品，AO/EB染料購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。BX41熒光顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，F(xiàn)ACS10流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECTON DICKISON公司產(chǎn)品。Sephadex G25柱購(gòu)于北京韋氏博慧色譜科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SK-BR-3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)，貼壁率達(dá)90%以上。在37 ℃，5%CO2飽和濕度下傳代培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞HER2蛋白的表達(dá) 以1:80的鼠抗人c-erbB-2單克隆抗體作為一抗，以1:200的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，檢測(cè)細(xì)胞表面HER2蛋白的表達(dá)。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，以緩沖液代替一抗進(jìn)行染色。

1.4 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)法檢測(cè)HER2表達(dá) 胰酶消化收集SK-BR-3細(xì)胞，滴片，參照膀胱癌細(xì)胞染色體及基因異常檢測(cè)試劑盒FISH產(chǎn)品說明書步驟，判斷SK-BR-3細(xì)胞Her2/neu基因的擴(kuò)增。紅色熒光為HER2基因擴(kuò)增，綠色熒光為17號(hào)染色體著絲粒序列標(biāo)記。計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞，觀察紅綠信號(hào)的比值，若紅綠信號(hào)比值≥2或紅色信號(hào)呈團(tuán)塊狀認(rèn)為HER2陽(yáng)性[2]。

1.5131I-Herceptin的制備及質(zhì)量控制 采用Iodogen法[3]標(biāo)記131I-Herceptin；運(yùn)用紙層析法測(cè)定131I-Herceptin的放射化學(xué)純度；計(jì)算131I-Herceptin的標(biāo)記率、131I-Herceptin的放射性比活度。

放射化學(xué)純度=紙層析中131I-Herceptin的放射性計(jì)數(shù)/紙層析中所有紙段的放射性計(jì)數(shù)(cpm)之和×100%；

131I-Herceptin的標(biāo)記率=第一峰(131I-Herceptin)的放射性測(cè)量值/所有洗脫液的放射性測(cè)量值×100%；

131I-Herceptin的放射性比活度(μci/mg)=標(biāo)記時(shí)Na131I的投入量(μci)×標(biāo)記率/標(biāo)記時(shí)投入的Herceptin量(mg)。

1.6 MTT法131I-Herceptin殺傷SK-BR-3細(xì)胞的IC15濃度 消化計(jì)數(shù)SK-BR-3細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活力。按4 000個(gè)/瓶接種于12.5 cm2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞貼壁，131I-Herceptin以完全培養(yǎng)基稀釋，倍比稀釋6個(gè)濃度。每瓶加入以完全培養(yǎng)基稀釋的131I-Herceptin液2mL(分別為125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9及1.8 μci/mL)，并設(shè)不加藥的細(xì)胞對(duì)照和背景對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行樣本。藥物作用12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，更換為1 mL PBS液和5 mg/mL的MTT液2 mL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入DMSO1.5 mL溶解沉淀，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。轉(zhuǎn)移液體于96孔板，測(cè)570 nm的吸光度A值，計(jì)算抑制率。抑制率=1-試驗(yàn)組的A值/對(duì)照度的A值。計(jì)算15%細(xì)胞死亡的藥物作用濃度(15% inhibiting concentration，IC15)。

1.7 克隆形成試驗(yàn) 培養(yǎng)SK-BR-3細(xì)胞，分為加藥組與對(duì)照組，均給予不同劑量的外照射(0、2、4、6 Gy)。按照射劑量由小到大分別接種4000、6000、8000、10 000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。接種細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待貼壁后，對(duì)照組更換2 mL的完全培養(yǎng)基1次；加藥組更換131I-Herceptin濃度為15.625 μci/mL的培養(yǎng)基2 mL。培養(yǎng)12 h后2組均更換為2 mL完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后予以高能X線外照射。由直線加速器產(chǎn)生6MV的X線，劑量率為3 Gy /min，照射野為40 cm×40 cm。照射時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)充滿培養(yǎng)基，SSD100 cm。照射后繼續(xù)培養(yǎng)10 d。計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆為1個(gè)克隆。計(jì)算克隆形成率(plating efficicy，PE)和存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction，SF)。PE=克隆形成數(shù)目/接種的細(xì)胞數(shù)，SF=PE受照細(xì)胞/PE未加任何處理因素的空白組。

1.8 AO/EB檢測(cè)細(xì)胞凋亡 SK-BR-3細(xì)胞以10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)，貼壁率達(dá)90%以上。在37 ℃，5%CO2飽和濕度下傳代培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。接種2 000個(gè)細(xì)胞于12.5 cm2的培養(yǎng)瓶。實(shí)驗(yàn)分4組：①空白組：無(wú)處理因素組；②藥物組：IC15131I-Herceptin組；③外照射組：2Gy高能X線照射；④聯(lián)合組：IC15131I-Herceptin+2Gy高能X線照射。每組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。處理因素作用24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入AO/EB染料4 μL混勻，置于培養(yǎng)瓶中1 d，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并觀察結(jié)果。

1.9 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期 按照1.8項(xiàng)下條件培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞濃度約(1～5)×106/mL。實(shí)驗(yàn)分4組：①空白組：無(wú)處理因素組；②藥物組：IC15131I-Herceptin作用組；③外照射組：2Gy高能X線照射；④聯(lián)合組：IC15131I-Herceptin+2Gy高能X線照射。每組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。處理因素作用24 h后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)細(xì)胞表面HER2表達(dá) 低倍鏡下評(píng)估染色的強(qiáng)度和百分比，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，所有SK-BR-3細(xì)胞表面均見褐色染色，其中約30%的細(xì)胞呈深褐色。SK-BR-3細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色證實(shí)為HER2蛋白高表達(dá)細(xì)胞，同以緩沖液代替一抗的對(duì)照組形成鮮明對(duì)比。見圖1。

圖1 SK-BR-3細(xì)胞2種染色結(jié)果(×100)A：SK-BR-3細(xì)胞免疫組化染色(HER2蛋白為褐色標(biāo)記)；B：對(duì)照組Fig.1 Two cell staining methods of SK-BR-3 cells(×100)A：immunohistochemical staining of SK-BR-3 cells(HER2 protein marked by brown)；B：control group

2.2 熒光免疫雜交法(FISH)法檢測(cè)HER2/neu的擴(kuò)增 20個(gè)細(xì)胞核中的信號(hào)計(jì)數(shù)結(jié)果，紅綠信號(hào)的比值均≥10，其中9個(gè)細(xì)胞的紅色信號(hào)連接成簇。見圖2。經(jīng)FISH法檢測(cè)SK-BR-3細(xì)胞存在HER2/neu基因擴(kuò)增。

圖2 FISH法檢測(cè)SK-BR-3細(xì)胞Her2/neu基因擴(kuò)增(×1 000)Fig.2 Gene amplification of Her2/neu in SK-BR-3 cells by FISH method(×1 000)

2.3131I-Herceptin的制備及質(zhì)量控制131I-Herceptin的標(biāo)記率為86.8%，放射化學(xué)純度為93.9%，放射性比活度為868.3 μci/mg。

2.4 MTT法篩選131I-Herceptin的作用濃度 不同濃度131I-Herceptin作用于SK-BR-3細(xì)胞抑制率見圖3，IC15(15%致死濃度)為15.625 μci/mL。

圖3 MTT法檢測(cè)不同濃度131I-Herceptin作用于SK-BR-3細(xì)胞的抑制率曲線(n=4)Fig.3 Inhibition ratio curve of SK-BR-3 cells treated with different concentrations of 131I-Herceptin by MTT(n=4)

2.5 克隆形成試驗(yàn) SK-BR-3細(xì)胞加藥組和對(duì)照組的存活分?jǐn)?shù)見表1。采用單變量?jī)梢蛩胤讲罘治鲞M(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)131I-Herceptin(F=628.008，P<0.001)及高能X線(F=964.970，P<0.001)對(duì)SK-BR-3細(xì)胞均有顯著的殺傷作用，可明顯降低細(xì)胞的SF值，且2者具有交互作用(F=113.046，P<0.001)，即2者協(xié)同降低SF值。

表1 2組SK-BR-3細(xì)胞的SF值Tab.

2.6 AO/EB檢測(cè)凋亡 4組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.324，P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行q檢驗(yàn)，每2組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以聯(lián)合組凋亡率最高。而4組細(xì)胞死亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.330，P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行q檢驗(yàn)，每2組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)行凋亡率兩因素方差分析，131I-Herceptin與高能X線照射2者存在交互作用(F=23.742，P<0.05)。表明外照射與藥物對(duì)細(xì)胞凋亡具有協(xié)同殺傷作用。見表2。

組別細(xì)胞凋亡率細(xì)胞死亡率空白組0.67±0.581.00±0.00外照射組28.00±4.004.00±1.00藥物組38.00±2.003.33±0.58聯(lián)合組46.00±5.003.67±0.58

2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的各組細(xì)胞周期 G1、G2、S、G2/G1期時(shí)各組之間的細(xì)胞比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36381.942、2918.75、6844.37、11.45，均P<0.001)。進(jìn)一步行q檢驗(yàn)，兩兩比較顯示，空白組、放療組、藥物組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但聯(lián)合組與其余3組間差異顯著(P<0.05)。由此得到，經(jīng)外照射及131I-Herceptin聯(lián)合作用后，細(xì)胞周期均發(fā)生明顯改變，由在空白組占主要地位的G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)移。見表3。

表3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的細(xì)胞周期±s，%)Tab.3 Cell cycle in each group detected by flow ±s，%)

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率占女性惡性腫瘤的第1位，并且逐年升高。近年來發(fā)病率和死亡率有明顯上升趨勢(shì)。有效的治療是改善預(yù)后和降低乳腺癌死亡率一個(gè)重要的方法。手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療為其常見的治療手段。如何能在現(xiàn)有治療水平上進(jìn)一步提高治療效果是目前研究方向。乳腺癌是放療中度敏感性腫瘤，藥物對(duì)放射線的協(xié)同殺傷效應(yīng)機(jī)制的探討是目前眾多研究的熱點(diǎn)[4]。

人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)為分子量185KD的受體，在HER2過度表達(dá)的乳腺癌患者中，疾病進(jìn)展快，預(yù)后差，對(duì)化療及內(nèi)分泌治療如三苯氧胺抗拒，缺乏有效治療手段。HER2過表達(dá)提示了乳腺癌的高度惡性及放療抗拒。

Herceptin的作用靶點(diǎn)是HER2基因調(diào)控的細(xì)胞表面P185糖蛋白。通過下調(diào)膜表面HER2蛋白的表達(dá)、抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活化、降低HER2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈中Akt和MARP的磷酸化水平，從而抑制了HER2過表達(dá)的生物效應(yīng)[5]。在體外實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)[1]，Herceptin具有放療增敏作用，其中Akt是放療增敏作用中的關(guān)鍵性信號(hào)傳導(dǎo)通路。Herceptin的分子作用可能是與高能X線有協(xié)同殺傷效應(yīng)的機(jī)制之一。

131I-Herceptin是一種放射免疫性藥物，將放射性核素131I與Herceptin相連接。本實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)記率為86.8%，放射化學(xué)純度為93.9%，放射性比活度為868.3 μci/mg。131I主要發(fā)射β射線，其最大能量為0.606MeV，平均能量為191 keV，空氣中1 m處劑量率為1.2 mSv/h/GBq，在組織中穿透距離為2～8 mm[6]。131I 已常規(guī)應(yīng)用于甲狀腺癌的治療，使細(xì)胞內(nèi)DNA變性、壞死，直至細(xì)胞死亡[7]。通過Herceptin與SK-BR-3細(xì)胞的緊密連接，將131I帶到SK-BR-3細(xì)胞的表面，靶向于HER2高表達(dá)腫瘤，對(duì)荷瘤裸鼠模型具有明顯的腫瘤抑制作用。且131I- Herceptin對(duì)HER2表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞株的殺傷作用較Herceptin、131I明顯增強(qiáng)[8]。

有研究證實(shí)[9]，Herceptin可將Her2過表達(dá)細(xì)胞的周期阻滯于G2期。試驗(yàn)中對(duì)照組細(xì)胞主要處于G1期，經(jīng)131I-Herceptin和外照射作用后均明顯向G2和S期轉(zhuǎn)化。而聯(lián)合組，即先用131I-Herceptin處理，再給予外照射時(shí)，更多的細(xì)胞被阻滯于G2期。4個(gè)組G2期細(xì)胞的含量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而G2期正是放療敏感的周期，這有可能是131I-Herceptin與高能X線具有協(xié)同殺傷作用的機(jī)制之一。

在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，131I-Herceptin與外照射聯(lián)合使用，可起到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的作用。由于外照射為分次、短時(shí)間、大劑量照射，而131I為持續(xù)照射，從使腫瘤細(xì)胞的潛在致死性損傷的修復(fù)受到抑制，增加了對(duì)腫瘤的殺傷作用。同時(shí)由于β線穿透能力的限制，正常組織的受照射量遠(yuǎn)小于腫瘤組織，可在使腫瘤細(xì)胞得到足夠照射量的同時(shí)，減輕對(duì)正常組織的損傷，使治療增益比變大。131I- Herceptin與高能X線聯(lián)合是一種具有臨床價(jià)值的治療方法。

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(編校：王儼儼)

Synergism effect of131I-Herceptin and high-energy X-ray on HER2 overexpressed breast cancer cells

ZHANG Ying1, YUAN Sheng-li2Δ, ZHENG Qin1, ZHANG Quan-an1, XU Han-feng1

(1. Department of Oncology, The Second Hospital of Nanjing, Nanjing 210003, China; 2. Department of Oncology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, China)

ObjectiveTo study the synergism effect of131I-Herceptin and high-energy X-ray on HER2 overexpressed breast cancer SK-BR-3 cells. MethodsThe protein expression and gene amplification of human epidermal growth factor receptor-2 (HER2) in SK-BR-3 cells were identified by immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization (FISH) method,131I-Herceptin was prepared by iodogen method, and the IC15 concentration of131I-Herceptin on SK-BR-3 cell were selected by MTT method. The cells were divided into control group and drug group according to131I-Herceptin used or not, and were delivered five different doses of external irradiation (0,2,4 and 6Gy), and the synergism effect was detected by colonogenic assay. The cells were divided into blank group, drug group(131I-Herceptin), X-ray group(2 Gy external irradiation) and combination group(131I-Herceptin+2 Gy external irradiation), the apoptosis rate and death rate were detected by AO/EB method and cell cycle were detected by flow cytometry. ResultsThe labling rate, radiochemical purity and specific radioactivity of131I-Herceptin were 86.8%,93.9% and 868.3 μci/mg, respectively. The IC15 of131I-Herceptin was 15.625 μci/mL.131I-Herceptin and high-energy X-ray significantly reduced surviving fraction (SF)(F=628.888，F(xiàn)=964.97，P<0.05) and there were interactions between them (F=113.046，P<0.05). There were significant differences in apoptosis rate and death rate among blank group, drug group, X-ray group and combination group(F=103.324，F(xiàn)=13.33，allP<0.05),and there were significant differences of pairwise comparison (P<0.05). After irradiation and131I-Herceptin administration, the cell cycle changed obviously from G1-phase to G2- and S-phase. Conclusion131I-Herceptincombined with high-energy X-ray has the synergism effect on HER2 overexpressed breast cancer SK-BR-3 cells.

breast cancer；human epidermal growth factor receptor-2；radioimmunotherapy; synergism

張迎，女，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：惡性腫瘤的放化療，E-mail：zhangyingqddx@163.com；袁勝利，通訊作者，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：肺癌、乳腺癌、消化道腫瘤的放化療及靶向治療，E-mail：huziandy@163.com。

R737.9

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1005-1678(2015)09-0044-04